Preparazione del campione per la criotomografia in situ di cellule di mammifero

1. Preparazione della griglia NOTA: Nel disegno sperimentale, pianificare un massimo di 8-12 griglie totali per sessione di surgelazione e 4-5 griglie per pozzetto. Inoltre, ciò porterà a una sessione di congelamento a tuffo molto lunga, che può causare un aumento dello stress cellulare, contaminazione da ghiaccio ed errori dell’utente. Scarica luminosaCaricare un numero appropriato di griglie con una pellicola di supporto in carbonio perforato da scaricare a incandescenza a 15 mA per 45 s a 0,39 mBar atmosfera in un dispositivo di scarica a incandescenza. Assicurati che il lato in carbonio della griglia sia rivolto verso l’alto. Al termine, trasferite le griglie in un contenitore pulito foderato con carta da filtro (Figura 1A 1).NOTA: È possibile utilizzare altre griglie purché il materiale non sia tossico per le celle (il che esclude qualsiasi griglia in rame). Le griglie del finder sono utili per gli studi correlativi. Sono possibili anche griglie realizzate con altri materiali. Molti laboratori hanno ottenuto buoni risultati facendo crescere le cellule sopra le griglie di supporto SiO2 8,9. Trattamento aderenteTrasferire le griglie, la fibronectina, il PBS, le piastre e le pinzette in una cabina di biosicurezza. Trattare entrambi i lati delle griglie con fibronectina bovina da 20 μg/mL micropipettando due punti di soluzione aderente di dimensioni generose su una superficie sterile, come il coperchio di una piastra a 6 pozzetti. Assicurarsi che i punti siano abbastanza grandi da avvolgere l’intera griglia (si consiglia circa 100 μL).NOTA: Prima del trattamento con la soluzione aderente selezionata, c’è la possibilità di foto-micropatternare la griglia qui per ottimizzare l’attaccamento delle cellule al centro dei quadrati della griglia. Riducendo la capacità delle celle di attaccarsi alle barre aumenterà il numero di celle visualizzabili. Questo è l’ideale per gli esperimenti che coinvolgono la fresatura crioFIB. Usa 5/15 pinzette per manipolare le griglie. Assicurarsi di trattare entrambi i lati della griglia in soluzione.NOTA: Possono essere utilizzate altre soluzioni adesive (fibrinogeno, collagene, altri componenti della matrice extracellulare, ecc.). La fibronectina viene utilizzata qui, in quanto dà buoni risultati con un’ampia varietà di linee cellulari. (U2OS, HeLa, Vero, Calu-3, Tzm-bl). La pinzetta 5/15 è utile in quanto la sua geometria consente una migliore manovrabilità intorno alle piastre a 6 pozzetti, alle piastre da 35 mm e ai micro vetrini. Ciò si traduce in una minore sollecitazione meccanica sulle griglie e in un film di carbonio più intatto. Assicurarsi che tutti i materiali necessari siano collocati nell’armadio di biosicurezza prima di iniziare, in quanto ciò riduce la possibilità di contaminazione della rete. Fissaggio di griglieUna volta trattata con fibronectina bovina, la griglia diventerà appiccicosa. Usando una pinzetta da 5/15, tocca delicatamente la superficie non in carbonio della griglia sul fondo di un piatto/piatto vuoto e apri le pinzette. La griglia dovrebbe fissarsi facilmente alla nuova superficie (Figura 1A2).NOTA: Cercare di evitare di posizionare le griglie al centro diretto o ai bordi del piatto/piatto. Quando si aggiungono cellule, c’è la tendenza ad accumulare densità cellulare al centro della piastra. Ciò può portare a griglie con un’eccessiva densità cellulare. In alternativa, è possibile utilizzare i supporti per griglie stampati in 3D invece di attaccare le celle direttamente alla superficie del piatto/piatto12. IncubazioneIncubare le griglie per 30 minuti nella soluzione aderente alla fibronectina (20 μg/mL). Per garantire che le griglie non si asciughino durante questo processo, micropipettare 1-2 gocce di soluzione più aderente direttamente sopra le griglie ogni 15 minuti (Figura 1A3).NOTA: Il periodo di incubazione varia a seconda della soluzione aderente utilizzata. Per la fibronectina bovina, il tempo consigliato è di 30 min. LavaggioDopo il periodo di incubazione, rimuovere la soluzione aderente in eccesso mediante micropipettaggio. Lavare le griglie micropipettando gocce di PBS direttamente sopra le griglie. Ripeti l’operazione 2-3 volte. (Figura 1A4). SterilizzazioneUtilizzare la luce UV per sterilizzare le griglie nella cabina di biosicurezza per 1 ora. Posizionare le griglie il più vicino possibile alla sorgente UV per massimizzare la sterilizzazione (Figura 1A5). Per garantire che le griglie non si asciughino durante questo processo, micropipetta 1-2 gocce di PBS direttamente sopra le griglie ogni 10 minuti.NOTA : I passaggi 1.4-1.6 possono essere eseguiti contemporaneamente. 2. Griglie di semina Conteggio celle:Staccare e contare le cellule utilizzando metodi meccanici o enzimatici. Determinare il numero ottimale di celle da utilizzare per la semina prima del conteggio. Per U2OS seminato in una piastra a 6 pozzetti, utilizzare un numero di cellule compreso tra 6 x 104 e 1,6 x 105 per pozzetto (Figura 1B1).NOTA: Il numero di cellule seminate varia in base al tipo di cellula, alla superficie del pozzetto, del piatto o del microvetrino utilizzato, al tempo che intercorre tra la semina e il congelamento a tuffo e al disegno sperimentale. Testare un intervallo di numeri di celle per identificare le condizioni che si tradurranno in 0,25-1 celle per quadrato della griglia al momento del congelamento a tuffo. È importante notare che un’elevata densità cellulare riduce la velocità di trasferimento del calore e può influire sul processo di vetrificazione. Per combattere questo, alcuni laboratori hanno avuto successo utilizzando filtri cellulari, che agiscono per prevenire la formazione di grumi cellulari13. Infine, questo protocollo si traduce nell’attaccamento casuale delle cellule allo strato di carbonio. Se è necessario un attacco mirato, è possibile utilizzare il foto-micropatterning (vedere il punto 1.3)14. Aggiunta di cellule e terreno di coltura: aggiungere le cellule tramite micropipetta ai pozzetti, evitando la formazione di bolle (Figura 1B2). In una piastra a 6 pozzetti, si consiglia un volume totale del pozzetto di 1,5-2,0 mL.NOTA: Si consiglia di bagnare accuratamente intorno alle griglie prima di aggiungere l’intero volume. Ciò contribuirà a evitare che le griglie si stacchino e fluttuino nella soluzione. Muovere delicatamente la piastra da un lato all’altro per facilitare una distribuzione omogenea delle cellule sul pozzetto. Non far roteare la piastra con un movimento circolare, poiché ciò comporterebbe un’eccessiva allocazione della densità cellulare al centro del pozzetto. Incubazione: Incubare i vetrini a 37 °C per un tempo adeguato secondo il disegno sperimentale, che dipenderà dalle applicazioni a valle. Per questo esempio (trasfezione di cloni molecolari di HIV), incubare tra le 16 e le 24 ore (Figura 1B3).NOTA: Tempi di incubazione più lunghi si tradurranno in più cicli di divisione cellulare. Pertanto, regolare di conseguenza il numero iniziale di celle per la semina. 3. Trasfezione Preparazione della miscela di trasfezione:Preparare un reagente liposomico cationico appropriato per la trasfezione del plasmide nella linea cellulare selezionata. In questo esempio di trasfezione, utilizzare 1 μg di DNA plasmidico totale per pozzetto (in una piastra a 6 pozzetti) da trasfettare con un rapporto 1:3 tra plasmide HIViΔEnv e plasmide psPAX2. Per ogni pozzetto, diluire 1 μg di DNA in 50 μL di DMEM esente da siero. Omogeneizzare la miscela mediante micropipettaggio ripetuto o rotazione delicata della piastra. Per ogni pozzetto, diluire 3 μL di reagente di trasfezione in DMEM privo di siero, quindi omogeneizzare nuovamente la miscela mediante micropipettaggio o leggera agitazione. Aggiungere l’intera miscela di reagenti di trasfezione diluita alla miscela di DNA diluito (fase 3.1.2) e incubare a temperatura ambiente (RT) per 15 minuti (Figura 1C1).NOTA: Durante l’incubazione di questa miscela, sostituire il terreno nei pozzetti con 1,5 mL di DMEM fresco. Fare attenzione a non rimuovere le griglie dal fondo del pozzo. Per applicare la miscela di trasfezione, pipettare 100 μL della miscela dal punto 3.1.3 goccia a goccia a ciascun pozzetto, concentrando le gocce sulle griglie per garantire il contatto (Figura 1C2). Cambiare il terreno di coltura 16-24 ore dopo la trasfezione (Figura 1C3). 4. Surgelazione a immersione NOTA: Mantenere le cellule a 37 °C fino al momento del blotting. Inoltre, assicurati di prendere nota del lato carbonio delle griglie durante tutto il processo. Densità cellulareControllare le griglie in un microscopio ottico invertito e annotare le densità delle cellule su ciascuna griglia.NOTA: le griglie con meno di 0,25 celle per quadrato della griglia (o una cella ogni 4 quadrati della griglia) sono considerate “vuote”. Le griglie con 0,25-1 celle per quadrato della griglia sono considerate “normali”. Le griglie con più di 1 cella per quadrato della griglia sono considerate “piene”. Prendere nota della densità delle celle su ciascuna griglia per consentire la composizione dei tempi di tamponamento in un secondo momento durante il surgelazione. Aggiungere 2-3 ml di PBS in un piatto vuoto e scaldare a 37 °C. Preparazione dei fiducialiPer preparare i fiduciali d’oro per le applicazioni di criotomografia a valle, pipettare 50 μL di soluzione di microsfere d’oro colloidale da 10 nm in una provetta pulita da 1,5 mL. Aggiungere 2 μL di 1 mg/mL di BSA alla provetta e omogeneizzare mediante micropipettaggio ripetuto. Centrifugare la provetta a 15.000-20.000 x g per 15 min. Micropipetta per rimuovere il più possibile il surnatante senza disturbare il pellet.NOTA: Il pellet sarà molto sciolto. Aggiungere 50 μL di PBS al pellet e risospendere. Centrifugare nuovamente la provetta a 15.000-20.000 x g per 15 min. Utilizzando una punta da 10 μL, aspirare direttamente 4 μL di pellet e trasferirlo in una provetta pulita da 1,5 mL (Figura 1D1). Utilizzare 1 μL di oro lavato e concentrato per griglia.NOTA: Il tipo di fiduciali utilizzati dipende dalle applicazioni a valle. Per la tomografia TEM, utilizzare perline d’oro da 10 nm. Per la tomografia a raggi X molli, utilizzare perline d’oro da 200 nm. Per la microscopia di correlazione, utilizzare perline di lattice fluorescenti. I fiduciali non sono normalmente necessari per gli esperimenti che coinvolgono la fresatura crioFIB, poiché il processo di macinazione li distruggerà. BlottingImpostare la camera climatica al 95% di umidità e a 30 °C (Figura 1D1). Selezionare una griglia utilizzando le pinzette 5/15. Lavate le griglie con PBS e trasferitele su una pinzetta a tuffo (Figura 1D2). Una volta fissate, rimuovere le pinzette 5/15 e far scorrere il morsetto sulle pinzette a immersione. Inserire la griglia nel congelatore a immersione, mantenendo il clamp saldamente (Figura 1D3). Aggiungere 1 μL di fiduciali d’oro sul lato posteriore della griglia (Figura 1D4). Aggiungere 2-3 μL di PBS sul lato carbonio della griglia. Utilizzare il tamponamento automatico per tamponare il lato posteriore della griglia e immergere il congelamento nell’etano liquido (Figura 1D5).NOTA: Si consiglia di avere tra 3-4 μL di volume per griglia per un blotting ottimale. Le griglie possono trattenere una quantità variabile di PBS dopo il lavaggio. Regolare il volume aggiunto di PBS per tenere conto della ritenzione di liquidi preesistente sulla griglia. Si consiglia di aggiungere i fiduciali dorati sul retro della griglia. L’aggiunta nella parte anteriore può portare a pool di fiduciali d’oro vicino al punto di inserimento, mentre l’aggiunta dalla parte posteriore si traduce in una soluzione più omogeneizzata. La durata del blotting dipende dall’odontoiatria cellulare della griglia. 2 s per le griglie vuote, 3 s per le normali e 4 s per le griglie piene, rispettivamente. Il tipo di congelatore a immersione disponibile può determinare il modo in cui viene affrontato il blotting: il congelatore a immersione Leica GP2 è quello utilizzato in questo protocollo ed è in grado di eseguire automaticamente il blotting su un lato per impostazione predefinita. Thermo Fisher Vitrobot esegue il blotting bifacciale automatizzato, anche se questo spesso danneggia le celle attaccate al lato in carbonio. È possibile anche il tamponamento manuale nel Vitrobot, così come gli stantuffi manuali a gravità.