哺乳动物细胞 原位 冷冻断层扫描的样品制备

1. 电网准备 注：在实验设计中，计划每次浸入冷冻期间最多 8-12 个网格，每孔最多 4-5 个网格。超过此值将导致非常长的冷冻过程，这可能会导致细胞压力增加、冰污染和用户错误。 辉光放电在辉光放电装置中，用穿孔碳支撑膜加载适当数量的网格，以 15 mA 的电流在 0.39 mBar 气氛下以 0.39 毫秒的电流进行辉光放电。 确保电网的碳面朝上。完成后，将网格转移到衬有滤纸的干净容器中（图1A1）。注意：只要材料对电池无毒（不包括任何铜网格），就可以使用其他网格。Finder 网格对于关联研究非常有用。也可以使用其他材料制成的网格。许多实验室在 SiO2 支持网格 8,9 上生长细胞取得了良好的结果。 依从性治疗将网格、纤连蛋白、PBS、板和镊子转移到生物安全柜中。通过在无菌表面（例如 6 孔板的盖子）上微量移液两个大大小的贴壁溶液点，用 20 μg/mL 牛纤连蛋白处理网格的两侧。确保点足够大以包裹整个网格（建议约 100 μL）。注：在用选定的贴壁溶液处理之前，可以选择在此处对网格进行光微图案化，以优化网格正方形中心细胞的附着。降低单元格附着到条形图的能力将增加可成像单元格的数量。这是涉及冷冻FIB研磨的实验的理想选择。 使用 5/15 镊子操作网格。确保在溶液中处理网格的两侧。注意：可以使用其他粘合剂溶液（纤维蛋白原、胶原蛋白、其他细胞外基质成分等）。这里使用纤连蛋白，因为它在多种细胞系中都能获得良好的结果。（U2OS、HeLa、Vero、Calu-3、Tzm-bl）。5/15 镊子非常有用，因为它的几何形状可以提高 6 孔板、35 mm 培养皿和微型载玻片周围的可操作性。这样可以减少网格上的机械应力，并形成更完整的碳膜。确保在开始之前将所有必需的材料都放在生物安全柜中，因为这样可以减少网格污染的可能性。 附加网格一旦用牛纤连蛋白处理，网格就会变得粘稠。使用 5/15 镊子，将网格的非碳表面轻轻接触空盘/盘子的底部，然后打开镊子。网格应易于附着在新表面上（图1A2）。注意： 尽量避免将网格放在盘子/盘子的直接中心或边缘。添加细胞时，细胞密度有在板中心积聚的趋势。这可能导致网格具有过高的细胞密度。或者，这里可以使用3D打印的网格支架，而不是将细胞直接连接到培养皿/板12的表面。 孵化将网格在纤连蛋白贴壁溶液（20μg/ mL）中孵育30分钟。为确保网格在此过程中不会变干，每15分钟将1-2滴更粘附的溶液直接滴在网格顶部（图1A3）。注意：孵育期将根据所使用的贴壁溶液而有所不同。对于牛纤连蛋白，推荐时间为 30 分钟。 洗涤孵育期过后，通过微量移液去除多余的粘附溶液。通过将PBS滴微量移液液直接在网格顶部来清洗网格。重复此操作 2-3 次。（图 1A4）。 灭菌使用紫外线对生物安全柜中的网格进行消毒1小时。将网格放置在尽可能靠近紫外线源的位置，以最大限度地提高灭菌效果（图1A5）。为确保网格在此过程中不会变干，每 10 分钟将 1-2 滴 PBS 直接滴在网格顶部。注意：步骤 1.4-1.6 可以同时执行。 2. 播种网格 细胞计数：使用机械或酶法分离和计数细胞。在计数之前确定用于接种的最佳细胞数。对于接种在 6 孔板中的 U2OS，每孔使用 6 x 104 至 1.6 x 105 个细胞之间的任意位置（图 1B1）。注：接种的细胞数量将根据细胞类型、孔的表面积、使用的培养皿或微载玻片、接种和浸入冷冻之间的时间以及实验设计而变化。测试一系列细胞数量，以确定在骤降冻结时将导致每个网格方块产生 0.25-1 个细胞的条件。需要注意的是，高细胞密度会降低传热速度，并可能影响玻璃化过程。为了解决这个问题，一些实验室已经发现使用细胞过滤器取得了成功，这种过滤器的作用是防止细胞团块形成13。最后，该协议导致细胞随机附着在碳层上。如果需要有针对性的附件，可以使用光微图案化（参见步骤 1.3）14。 添加细胞和生长培养基：通过微量移液管将细胞添加到孔中，避免气泡（图1B2）。在 6 孔板中，建议总孔体积为 1.5-2.0 mL。注意： 建议在添加整个体积之前小心地弄湿网格周围。这将有助于防止网格在溶液中分离和浮动。轻轻地左右移动板，以促进孔上的细胞均匀分布。不要以圆周运动旋转板，因为这会导致孔中心分配过多的细胞密度。 孵育：根据实验设计，将载玻片在37°C下孵育适当的时间，这将取决于下游应用。对于本例（HIV分子克隆的转染），孵育16-24小时（图1B3）。注意：较长的孵育时间将导致更多的细胞分裂周期。因此，请相应地调整接种的细胞起始数量。 3. 转染 制备转染混合物：制备适当的阳离子脂质体试剂，用于将质粒转染到所选细胞系中。 在该转染示例中，每孔（在 6 孔板中）使用 1 μg 总质粒 DNA，以 1：3 的比例转染 HIViΔEnv 质粒与 psPAX2 质粒。对于每个孔，将 1 μg DNA 稀释到 50 μL 无血清 DMEM 中。通过反复微量移液或轻轻旋转板来匀浆混合物。 对于每个孔，在无血清DMEM中稀释3μL转染试剂，然后通过微量移液或轻轻旋转再次匀浆混合物。将整个稀释的转染试剂混合物加入稀释的DNA混合物中（步骤3.1.2），并在室温（RT）下孵育15分钟（图1C1）。注意：当该混合物孵育时，用 1.5 mL 新鲜 DMEM 替换孔中的培养基。小心不要将格栅从井底移开。 为了应用转染混合物，将步骤3.1.3中的100μL混合物逐滴移液到每个孔中，将液滴集中在网格上以确保接触（图1C2）。转染后16-24小时更换生长培养基（图1C3）。 4.骤降冻结 注意：将细胞保持在37°C，直到需要印迹。此外，在整个过程中，请务必记下电网的碳侧。 细胞密度在倒置光学显微镜中检查网格，并注意每个网格上的细胞密度。注意：每个网格方块少于 0.25 个单元格（或每 4 个网格方块一个单元格）的网格被视为“空”。每个网格方格有 0.25-1 个像元的网格被认为是“正常”的。每个格子方块具有 1 个以上像元的格网被视为“已满”。 记下每个网格上的细胞密度，以便在速冻期间稍后调整印迹时间。将2-3mL PBS加入空板/培养皿中，并加热至37°C。 准备基准点为了制备用于下游冷冻断层扫描应用的金基准点，将 50 μL 10 nm 胶体金珠溶液移液到干净的 1.5 mL 试管中。向试管中加入 2 μL 1 mg/mL BSA，并通过反复微量移液匀浆。 将试管以15,000-20,000× g 离心15分钟。微量移液器在不干扰沉淀的情况下尽可能多地去除上清液。注意：颗粒会非常松散。 向沉淀中加入 50 μL PBS 并重悬。再次以15,000-20,000× g 离心管15分钟。 使用 10 μL 吸头，直接吸出 4 μL 沉淀，并将其转移到干净的 1.5 mL 管中（图 1D1）。每个网格使用 1 μL 洗涤和浓缩的金。注意：使用的基准点类型取决于下游应用。对于 TEM 断层扫描，请使用 10 nm 金珠。对于软 X 射线断层扫描，请使用 200 nm 金珠。对于相关显微镜检查，请使用荧光乳胶珠。对于涉及冷冻FIB研磨的实验，基准点通常不是必需的，因为研磨过程会破坏它们。 杂交将环境室设置为95%的湿度和30°C（图1D1）。使用 5/15 镊子选择网格。 用PBS清洗网格并将它们转移到插入镊子上（图1D2）。固定后，取出 5/15 镊子并滑动夹子amp 在插入镊子上。 将网格插入切入式冷冻机，保持夹子牢固（图 1D3）。向网格的背面加入1μL金基准点（图1D4）。将 2-3 μL PBS 添加到网格的碳侧。使用自动印迹法印迹网格的背面，并将冷冻液浸入液态乙烷中（图1D5）。注：建议每个网格的体积在 3-4 μL 之间，以获得最佳印迹效果。洗涤后，网格可能会保留不同量的 PBS。调整增加的 PBS 体积，以考虑网格上预先存在的液体潴留。建议将黄金基准点添加到网格的背面。在前面加法会导致在插入点附近产生金基准点池，而从后面加法会导致更均匀的解决方案。印迹持续时间取决于网格的细胞牙科。空格格分别为 2 秒、正常格栅为 3 秒、全格格为 4 秒。可用的速冻仪类型可能决定了印迹的方法：徕卡GP2速冻仪是该协议中使用的速冻机，默认情况下能够进行自动单面印迹。Thermo Fisher Vitrobot 可进行自动双面印迹，但这通常会损坏附着在碳侧的细胞。也可以在 Vitrobot 中进行手动印迹，也可以使用手动重力柱塞。