Фенотипическое профилирование дофаминергических нейронов среднего мозга человека, полученных из стволовых клеток человека

При болезни Паркинсона (БП) нарушаются различные клеточные биологические процессы. Например, митохондриальная дисфункция, окислительный стресс, дефекты деградации белков, нарушение везикулярного транспорта и эндолизосомальной функции, связанные с потерей дофаминергических нейронов среднего мозга (мДА), обычно наблюдаются при БП¹. Таким образом, болезнь Паркинсона, по-видимому, включает в себя несколько механизмов заболевания, которые могут взаимодействовать друг с другом и ухудшать друг друга. Одним из полезных способов исследования этого механистического взаимодействия является создание комплексного фенотипического отпечатка пальца или профиля дофаминергических нейронов среднего мозга (mDA).

Фенотипическое профилирование – это подход, который включает в себя создание профиля выборки на основе набора измеримых характеристик и, во-вторых, прогнозирование выборки на основе этого профиля ^2,3. Цель профилирования состоит в том, чтобы зафиксировать широкий спектр признаков, некоторые из которых, возможно, ранее не были связаны с заболеванием или лечением³. В результате профилирование может выявить неожиданные биологические процессы. Фенотипическое профилирование, как правило, опирается на флуоресцентно окрашенные клетки, и для создания фенотипических^{профилей были} разработаны стандартизированные анализы, такие как Cell Painting. В последнее время фенотипическое профилирование, например, применяется для характеризации малых молекул или точного прогнозирования подтипов БП исключительно на основе фибробластов, полученных от пациентов ^5,6. Несмотря на эти достижения, фенотипическое профилирование редко применялось к постмитотическим дифференцированным клеткам, таким как индуцированные плюрипотентные стволовые клетки человека (iPSC) нейроны mDA, которые экспрессируют PD-сцепленные мутации, такие как LRRK2 G2019S. К существенным проблемам моделей, полученных на основе ИПСК, относятся наличие малозаметных или вариабельных патологических признаков в группах дифференцировки или генотипах, а также тот факт, что изолированные фенотипы БП не охватывают всю сложность заболевания. Кроме того, несмотря на то, что нейронные модели ИПСК являются физиологически значимыми, они редко используются в процессах разработки лекарств для лечения БП из-за опасений по поводу технической сложности ^7,8.

Ранее мы разработали надежную методологию для измерения нескольких патофизиологических фенотипов, связанных с болезнью Паркинсона, в нейронах мДА человека, которые чувствительны как к генетическим, так и к химическим соединениям фенотипическим^{изменениям}. В данной статье подробно описывается дальнейшая оптимизированная версия этой методики для создания фенотипических профилей из нейронов mDA (рис. 1). Этот протокол имеет ряд преимуществ по сравнению с ранее описанными подходами к фенотипическому профилированию, такими как использование высококачественных нейронов mDA и техническая воспроизводимость. Впервые этот протокол позволяет осуществлять фенотипическое профилирование физиологически значимых постмитотических нейронов mDA после химических возмущений с высокой степенью масштабируемости. Полностью дифференцированные и криоконсервированные нейроны mDA коммерчески доступны, что значительно снижает вариабельность дифференцировки от партии к партии. Во-вторых, техническая вариабельность может быть дополнительно снижена за счет использования четко определенного плана эксперимента (т.е. продолжительности культивирования или отказа от краевых лунок), автоматизированной обработки жидкостей и автоматизированной микроскопии. Кроме того, здесь описаны начальные этапы анализа фенотипического профиля с использованием неконтролируемой кластеризации или контролируемой классификации, а также указано, как можно анализировать данные фенотипического профилирования. Этот протокол будет полезен исследователям, интересующимся фенотипическими изменениями нейронов mDA, индуцированными генетическими или химическими возмущениями, в частности, когда требуется высокомасштабируемая исследовательская установка, например, во время скрининговых кампаний или когда необходимо изучить влияние меньшего числа соединений, например, для определения токсических эффектов. Таким образом, предполагается, что применение фенотипического профилирования нейронов человека является ценным методом для изучения сложных фенотипов, связанных с заболеванием, и характеристики клеточных эффектов кандидатов в лекарственные препараты.

Рисунок 1: Схематическое изображение экспериментального протокола для создания фенотипических профилей на основе изображений из нейронов мДА человека, полученных из ИПСК. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.