İnsan Kök Hücre Kaynaklı Orta Beyin Dopaminerjik Nöronlarının Fenotipik Profillemesi
Summary
Bu protokol, insan orta beyin dopaminerjik nöronlarının hücre kültürünü, ardından immünolojik boyamayı ve genetik veya kimyasal modülasyonlara bağlı fenotipik varyasyonların tanımlanmasına izin veren elde edilen mikroskobik yüksek içerikli görüntülerden nöronal fenotipik profillerin oluşturulmasını tanımlar.
Abstract
Parkinson hastalığı (PH), orta beyin dopaminerjik (mDA) nöron kaybına neden olan bir dizi hücre biyolojik süreciyle bağlantılıdır. Mevcut birçok in vitro PD hücresel modeli karmaşıklıktan yoksundur ve çoklu fenotipleri hesaba katmaz. İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre (iPSC) kaynaklı mDA nöronlarındaki fenotipik profilleme, PD ile ilgili bir hücre tipinde bir dizi nöronal fenotipi paralel olarak aynı anda ölçerek bu eksiklikleri giderebilir. Burada, ticari olarak temin edilebilen insan mDA nöronlarından fenotipik profiller elde etmek ve analiz etmek için bir protokol açıklıyoruz. Nükleer, α-sinüklein, Tirozin hidroksilaz (TH) ve Mikrotübül ile ilişkili protein 2 (MAP2) ile ilgili fenotipleri görselleştirmek için nörona özgü bir floresan boyama paneli kullanılır. Açıklanan fenotipik profilleme protokolü, 384 oyuklu plakalar, otomatik sıvı işleme ve yüksek verimli mikroskopi kullandığından ölçeklenebilir. Protokolün faydası, Lösin açısından zengin tekrar kinaz 2 (LRRK2) geninde PD’ye bağlı G2019S mutasyonunu taşıyan sağlıklı donör mDA nöronları ve mDA nöronları kullanılarak örneklendirilmiştir. Her iki hücre hattı da LRRK2 kinaz inhibitörü PFE-360 ile tedavi edildi ve fenotipik değişiklikler ölçüldü. Ek olarak, çok boyutlu fenotipik profillerin kümeleme veya makine öğrenimine dayalı denetimli sınıflandırma yöntemleri kullanılarak nasıl analiz edilebileceğini gösteriyoruz. Açıklanan protokol, özellikle nöronal hastalık modellemesi üzerinde çalışan veya insan nöronlarındaki kimyasal bileşik etkilerini inceleyen araştırmacıların ilgisini çekecektir.
Introduction
Parkinson hastalığında (PH) çeşitli hücre biyolojik süreçleri bozulur. Örneğin, mitokondriyal disfonksiyon, oksidatif stres, protein yıkım kusurları, veziküler kaçakçılığın bozulması ve endolizozomal fonksiyon, orta beyin dopaminerjik (mDA) nöron kaybı ile ilişkilendirilmiştir ve PD1’de yaygın olarak gözlenir. Bu nedenle, PH, birbiriyle etkileşime girebilen ve birbirini kötüleştirebilen çoklu hastalık mekanizmalarını içeriyor gibi görünmektedir. Bu mekanik etkileşimi araştırmanın yararlı bir yolu, kapsamlı bir fenotipik parmak izinin veya orta beyin dopaminerjik (mDA) nöronlarının profilinin oluşturulmasıdır.
Fenotipik profilleme, ölçülebilir özelliklerin bir koleksiyonuna dayalı olarak bir örneklem profilinin oluşturulmasını içeren bir yaklaşımdır ve ikincisi, bu profile dayalı olarak bir örneklem hakkında tahminlerde bulunmayı içerir 2,3. Profil oluşturmanın amacı, bazıları daha önce bir hastalık veya tedavi ile ilişkilendirilmemiş olabilecek çok çeşitli özellikleri yakalamaktır3. Sonuç olarak, profil oluşturma beklenmedik biyolojik süreçleri ortaya çıkarabilir. Fenotipik profilleme tipik olarak floresan lekeli hücrelere dayanır ve fenotipik profiller oluşturmak için Hücre Boyama gibi standartlaştırılmış testler geliştirilmiştir4. Son zamanlarda, fenotipik profilleme, örneğin, küçük moleküllerin karakterizasyonu veya yalnızca hasta kaynaklı fibroblastlaradayalı PD alt tiplerinin doğru tahmini için uygulanmıştır 5,6. Bu ilerlemelere rağmen, fenotipik profilleme, LRRK2 G2019S gibi PD’ye bağlı mutasyonları eksprese eden insan kaynaklı pluripotent kök hücre (iPSC) türevi mDA nöronları gibi mitotik sonrası farklılaşmış hücrelere nadiren uygulanmıştır. iPSC’den türetilen modellerin önemli zorlukları arasında, farklılaşma grupları veya genotipler arasında ince veya değişken patolojik özelliklerin varlığı ve izole PD fenotiplerinin hastalığın tüm karmaşıklığını yakalayamaması yer alır. Ayrıca, iPSC nöronal modelleri fizyolojik olarak ilgili olsa da, teknik karmaşıklık ile ilgili endişeler nedeniyle PD ilaç keşif süreçlerinde nadiren kullanılmaktadır 7,8.
Daha önce, hem genetik hem de kimyasal bileşik kaynaklı fenotipik değişikliklere duyarlı olan insan mDA nöronlarında PD ile ilişkili çoklu patofizyolojik fenotipleri ölçmek için sağlam bir metodoloji geliştirmiştik9. Bu makale, mDA nöronlarından fenotipik profiller oluşturmak için bu metodolojinin daha da optimize edilmiş bir versiyonunu ayrıntılı olarak açıklamaktadır (Şekil 1). Bu protokolün, yüksek kaliteli mDA nöronlarının kullanımı ve teknik tekrarlanabilirlik gibi daha önce açıklanan fenotipik profilleme yaklaşımlarına göre çeşitli avantajları vardır. İlk kez, bu protokol, kimyasal bozulmalardan sonra fizyolojik olarak ilgili post-mitotik mDA nöronlarında fenotipik profillemeyi yüksek düzeyde ölçeklenebilir bir şekilde mümkün kılar. Tamamen farklılaşmış ve dondurularak korunmuş mDA nöronları ticari olarak temin edilebilir ve partiden partiye farklılaşma değişkenliğini önemli ölçüde azaltır. İkinci olarak, teknik değişkenlik, iyi tanımlanmış bir deneysel tasarım (yani, kültür süresi veya kenar kuyularından kaçınma), otomatik sıvı işleme ve otomatik mikroskopi kullanılarak daha da azaltılabilir. Ek olarak, denetimsiz kümeleme veya denetimli sınıflandırma yaklaşımları kullanılarak fenotipik profil analizinin ilk adımları burada özetlenmiştir ve fenotipik profilleme verilerinin nasıl analiz edilebileceğini göstermektedir. Bu protokol, genetik veya kimyasal bozulmaların neden olduğu mDA nöronlarının fenotipik değişiklikleriyle ilgilenen araştırmacılar için, özellikle yüksek düzeyde ölçeklenebilir bir çalışma kurulumu gerektiğinde, örneğin tarama kampanyaları sırasında veya daha az sayıda bileşiğin etkilerinin incelenmesi gerektiğinde, örneğin toksik etkileri belirlemek için kullanılacaktır. Özetle, insan nöronlarının fenotipik profillemesinin uygulanmasının, hastalıkla ilgili karmaşık fenotipleri incelemek ve ilaç adaylarının hücresel etkilerini karakterize etmek için değerli bir teknik olduğu tahmin edilmektedir.
Şekil 1: İnsan iPSC’den türetilen mDA nöronlarından görüntü tabanlı fenotipik profiller oluşturmak için deneysel protokolün şematik tasviri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fenotipik profilleme, floresan boyama, mikroskopi ve görüntü analizi uygulayarak hücrelerdeki çok sayıda fenotipi ölçmek için kullanılan bir tekniktir3. Fenotipik profiller, hücresel biyolojide tek bir okuma kullanıldığında fark edilmeyebilecek karmaşık değişiklikleri anlamak için hücre hatları veya diğer deneysel koşullar arasında elde edilebilir ve karşılaştırılabilir. Burada, PD hücresel biyolojisini modellemek için sıklıkla kullanılan bir hücre tipi olan ins…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, sunulan protokolün tasarımına yol açan değerli yardımları ve tartışmaları için Ksilink’teki tüm meslektaşlarına teşekkür eder.
Materials
| Anti- chicken – Alexa 647 | Jackson ImmunoRearch | 703-605-155 | Immunofluorescence |
| Anaconda | https://www.anaconda.com/download | ||
| Anti-Map2 | Novus | NB300-213 | Immunofluorescence |
| Anti-mouse – Alexa 488 | Thermo Fisher | A11001 | Immunofluorescence |
| Anti-rabbit – Alexa 555 | Thermo Fisher | A21429 | Immunofluorescence |
| Anti-Tyrosine Hydroxylase | Merck | T2928 | Immunofluorescence |
| Anti-α-synuclein | Abcam | 138501 | Immunofluorescence |
| Bravo Automated Liquid Handling Platform with 384ST head | Agilent | If no liquid handler is available, the use of an electronic multichannel pipette is recommended. | |
| Confocal microscope | Yokogawa | CV7000 | The use of an automated confocal fluorescence microscope is recommended to ensure image quality consistency. |
| Countess Automated cell counter | Invitrogen | Cell counting before seeding. Can also be done using a manual counting chamber. | |
| DPBS +/+ | Gibco | 14040-133 | Buffer for washing |
| EL406 Washer Dispenser | BioTek (Agilent) | If no liquid handler is available, the use of an electronic multichannel pipette is recommended. | |
| Formaldehyde Solution (PFA 16 %) | Euromedex | EM-15710-S | Fixation before staining |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | Nuclear staining |
| iCell Base Medium 1 | Fujifilm | M1010 | Base medium for neurons |
| iCell DPN, Donor#01279, Phenotype AHN, lot#106339, 1M | Fujifilm | C1087 | Apparently healthy donor |
| iCell DPN, Donor#11299, Phenotype LRRK2 G2019S, phenotype PD lot#106139 | Fujifilm | C1149 | Donor carrying LRRK2 G2019S mutation |
| iCell Nervous System Supplement | Fujifilm | M1031 | Supplement for base medium |
| iCell Neural Supplement B | Fujifilm | M1029 | Supplement for base medium |
| Jupyter Python Notebook | In-house development | https://github.com/Ksilink/Notebooks/tree/main/Neuro/DopaNeuronProfiling | Notebook to perform phenotypic profile visualization and classification from raw data. |
| Laminin | Biolamina | LN521 | Plate coating |
| PFE-360 | MedChemExpress | HY-120085 | LRRK2 kinase inhibitor |
| PhenoLink | In-house development | https://github.com/Ksilink/PhenoLink | Software for image analysis |
| PhenoPlate 384w, PDL coated | Perkin Elmer | 6057500 | Pre-coated plate for cell culture and imaging. This plate allows imaging of all wells using all objectives of the Yokogawa CV7000 microscope. |
| Storage plates Abgene 120 µL | Thermo Scientific | AB-0781 | Necessary for compound dispensing using the Vprep pipetting system. If not available, the use of an electronic multichannel pipette is recommended. |
| Triton | Sigma | T9284 | Permeabilization before lysis |
| Trypan Blue | Sigma | T8154-20ML | Determination of living cells |
| Vprep Pipetting System | Agilent | Medium change and compound dispensing. Alternatively, an electronic multichannel pipette can be used. |
References
- Panicker, N., Ge, P., Dawson, V. L., Dawson, T. M. The cell biology of Parkinson’s disease. The Journal of Cell Biology. 220 (4), 202012095 (2021).
- Caicedo, J. C., et al. Data-analysis strategies for image-based cell profiling. Nature Methods. 14 (9), 849-863 (2017).
- Chandrasekaran, S. N., Ceulemans, H., Boyd, J. D., Carpenter, A. E. Image-based profiling for drug discovery: due for a machine-learning upgrade. Nature Reviews Drug Discovery. 20 (2), 145-159 (2021).
- Bray, M. -. A., et al. Cell Painting, a high-content image-based assay for morphological profiling using multiplexed fluorescent dyes. Nature Protocols. 11 (9), 1757-1774 (2016).
- Schiff, L., et al. Integrating deep learning and unbiased automated high-content screening to identify complex disease signatures in human fibroblasts. Nature Communications. 13 (1), 1590 (2022).
- Ziegler, S., Sievers, S., Waldmann, H. Morphological profiling of small molecules. Cell Chemical Biology. 28 (3), 300-319 (2021).
- Cobb, M. M., Ravisankar, A., Skibinski, G., Finkbeiner, S. iPS cells in the study of PD molecular pathogenesis. Cell and Tissue Research. 373 (1), 61-77 (2018).
- Elitt, M. S., Barbar, L., Tesar, P. J. Drug screening for human genetic diseases using iPSC models. Human Molecular Genetics. 27 (R2), 89-98 (2018).
- Vuidel, A., et al. High-content phenotyping of Parkinson’s disease patient stem cell-derived midbrain dopaminergic neurons using machine learning classification. Stem Cell Reports. 17 (10), 2349-2364 (2022).
- Stirling, D. R., Swain-Bowden, M. J., Lucas, A. M., Carpenter, A. E., Cimini, B. A., Goodman, A. CellProfiler 4: improvements in speed, utility and usability. BMC Bioinformatics. 22 (1), 433 (2021).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Sofroniew, N., et al. . napari: a multi-dimensional image viewer for Python. , (2022).
- Berthold, M. R., et al. KNIME: The Konstanz Information Miner. Data Analysis, Machine Learning and Applications. , 319-326 (2008).
- Fathi, A., et al. Diverging Parkinson’s Disease Pathology between patient-derived GBAN370S, LRRK2G2019S and engineered SNCAA53T iPSC-derived Dopaminergic Neurons. bioRxiv. , (2023).
- Wang, Y., Huang, H., Rudin, C., Shaposhnik, Y. Understanding How Dimension Reduction Tools Work: An Empirical Approach to Deciphering t-SNE, UMAP, TriMap, and PaCMAP for Data Visualization. Journal of Machine Learning Research. 22 (201), 1-73 (2021).
- Ke, G., et al. LightGBM: A highly efficient gradient boosting decision tree. Advances in Neural Information Processing Systems. 30, (2017).
- Avazzadeh, S., Baena, J. M., Keighron, C., Feller-Sanchez, Y., Quinlan, L. R. Modelling Parkinson’s Disease: iPSCs towards Better Understanding of Human Pathology. Brain Sciences. 11 (3), 373 (2021).
- Sánchez-Danés, A., et al. Disease-specific phenotypes in dopamine neurons from human iPS-based models of genetic and sporadic Parkinson’s disease. EMBO Molecular Medicine. 4 (5), 380-395 (2012).
- Oosterveen, T., et al. Pluripotent stem cell derived dopaminergic subpopulations model the selective neuron degeneration in Parkinson’s disease. Stem Cell Reports. 16 (11), 2718-2735 (2021).
- Hughes, R. E., et al. Multiparametric high-content cell painting identifies copper ionophores as selective modulators of esophageal cancer phenotypes. ACS Chemical Biology. 17 (7), 1876-1889 (2022).
- Akbarzadeh, M., et al. Morphological profiling by means of the Cell Painting assay enables identification of tubulin-targeting compounds. Cell Chemical Biology. 29 (6), 1053-1064 (2022).
- Schiff, L., et al. Integrating deep learning and unbiased automated high-content screening to identify complex disease signatures in human fibroblasts. Nature Communications. 13 (1), 1590 (2022).
- Way, G. P., et al. Morphology and gene expression profiling provide complementary information for mapping cell state. Cell Systems. 13 (11), 911-923 (2022).
- Feng, Y., Mitchison, T. J., Bender, A., Young, D. W., Tallarico, J. A. Multi-parameter phenotypic profiling: using cellular effects to characterize small-molecule compounds. Nature Reviews Drug Discovery. 8 (7), 567-578 (2009).
- Antonov, S. A., Novosadova, E. V. Current state-of-the-art and unresolved problems in using human induced pluripotent stem cell-derived dopamine neurons for parkinson’s disease drug development. International Journal of Molecular Sciences. 22 (7), 3381 (2021).
- Miller, J. D., et al. Human iPSC-based modeling of late-onset disease via progerin-induced aging. Cell Stem Cell. 13 (6), 691-705 (2013).
- Bezard, E., Gross, C. E., Brotchie, J. M. Presymptomatic compensation in Parkinson’s disease is not dopamine-mediated. Trends in Neurosciences. 26 (4), 215-221 (2003).
- Wu, Y., Le, W., Jankovic, J. Preclinical Biomarkers of parkinson disease. Archives of Neurology. 68 (1), 22-30 (2011).
- Verstraelen, P., et al. Systematic quantification of synapses in primary neuronal culture. iScience. 23 (9), 101542 (2020).
- Liu-Yesucevitz, L., et al. ALS-Linked mutations enlarge TDP-43-enriched neuronal RNA granules in the dendritic arbor. The Journal of Neuroscience. 34 (12), 4167-4174 (2014).
