Profilo fenotipico dei neuroni dopaminergici del mesencefalo derivati da cellule staminali umane

Una varietà di processi biologici cellulari sono disturbati nella malattia di Parkinson (PD). Ad esempio, la disfunzione mitocondriale, lo stress ossidativo, i difetti di degradazione delle proteine, l’interruzione del traffico vescicolare e la funzione endolisosomiale sono stati associati alla perdita di neuroni dopaminergici del mesencefalo (mDA), sono comunemente osservati nella PD¹. Pertanto, la malattia di Parkinson sembra coinvolgere molteplici meccanismi patologici che possono interagire e peggiorarsi a vicenda. Un modo utile per studiare questa interazione meccanicistica è la creazione di un’impronta digitale fenotipica completa o di un profilo dei neuroni dopaminergici del mesencefalo (mDA).

La profilazione fenotipica è un approccio che prevede la creazione di un profilo di un campione basato su una raccolta di caratteristiche misurabili e, in secondo luogo, comporta la formulazione di previsioni su un campione basato su questo profilo ^2,3. L’obiettivo della profilazione è quello di acquisire una vasta gamma di caratteristiche, alcune delle quali potrebbero non essere state precedentemente associate a una malattia o a un trattamento³. Di conseguenza, la profilazione può rivelare processi biologici inaspettati. La profilazione fenotipica si basa tipicamente su cellule colorate con fluorescenza e saggi standardizzati, come il Cell Painting, sono stati sviluppati per creare profili fenotipici⁴. Recentemente, la profilazione fenotipica è stata, ad esempio, applicata per la caratterizzazione di piccole molecole o per la predizione accurata di sottotipi di PD basati esclusivamente su fibroblasti derivati da pazienti ^5,6. Nonostante questi progressi, il profilo fenotipico è stato raramente applicato a cellule differenziate post-mitotiche, come i neuroni mDA derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane (iPSC) che esprimono mutazioni legate al PD come LRRK2 G2019S. Le sfide significative dei modelli derivati da iPSC includono la presenza di caratteristiche patologiche sottili o variabili tra i lotti di differenziazione o i genotipi e il fatto che i fenotipi isolati di PD non catturano l’intera complessità della malattia. Inoltre, mentre i modelli neuronali di iPSC sono fisiologicamente rilevanti, sono raramente utilizzati nei processi di scoperta di farmaci per la malattia di Parkinson a causa di preoccupazioni sulla complessità tecnica ^7,8.

In precedenza abbiamo sviluppato una solida metodologia per misurare più fenotipi fisiopatologici correlati al PD nei neuroni mDA umani che sono sensibili ai cambiamenti fenotipici indotti da composti genetici e chimici⁹. Questo articolo descrive in dettaglio una versione ulteriormente ottimizzata di questa metodologia per creare profili fenotipici da neuroni mDA (Figura 1). Questo protocollo presenta diversi vantaggi rispetto agli approcci di profilazione fenotipica descritti in precedenza, come l’uso di neuroni mDA di alta qualità e la riproducibilità tecnica. Per la prima volta, questo protocollo consente la profilazione fenotipica nei neuroni mDA post-mitotici fisiologicamente rilevanti dopo perturbazioni chimiche in modo altamente scalabile. I neuroni mDA completamente differenziati e crioconservati sono disponibili in commercio, riducendo significativamente la variabilità della differenziazione da lotto a lotto. In secondo luogo, la variabilità tecnica può essere ulteriormente ridotta utilizzando un disegno sperimentale ben definito (ad esempio, la durata della coltura o evitando i pozzetti di bordo), la manipolazione automatizzata dei liquidi e la microscopia automatizzata. Inoltre, le fasi iniziali dell’analisi del profilo fenotipico utilizzando approcci di clustering non supervisionato o classificazione supervisionata sono descritte qui, indicando come possono essere analizzati i dati di profilazione fenotipica. Questo protocollo sarà utile per i ricercatori interessati ai cambiamenti fenotipici dei neuroni mDA indotti da perturbazioni genetiche o chimiche, in particolare quando è richiesta una configurazione di studio altamente scalabile, ad esempio durante le campagne di screening o quando gli effetti di un numero minore di composti devono essere studiati, ad esempio, per determinare gli effetti tossici. In sintesi, si prevede che l’applicazione del profilo fenotipico dei neuroni umani sia una tecnica preziosa per studiare fenotipi complessi correlati alla malattia e caratterizzare gli effetti cellulari dei farmaci candidati.

Figura 1: Rappresentazione schematica del protocollo sperimentale per generare profili fenotipici basati su immagini da neuroni mDA umani derivati da iPSC. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.