ヒト幹細胞由来中脳ドーパミン作動性ニューロンの表現型プロファイリング

パーキンソン病(PD)では、さまざまな細胞生物学的プロセスが妨げられています。例えば、ミトコンドリアの機能不全、酸化ストレス、タンパク質分解の欠陥、小胞輸送の破壊、およびエンドリソソーム機能は、中脳ドーパミン作動性(mDA)ニューロンの喪失と関連しており、^PD1で一般的に観察されます。したがって、PDには、互いに相互作用して悪化する可能性のある複数の疾患メカニズムが関与しているようです。この機構の相互作用を調査する有用な方法の1つは、中脳ドーパミン作動性(mDA)ニューロンの包括的な表現型フィンガープリントまたはプロファイルの作成です。

表現型プロファイリングは、測定可能な特性のコレクションに基づいてサンプルのプロファイルを作成するアプローチであり、次に、このプロファイルに基づいてサンプルに関する予測を行うことが含まれます^2,3。プロファイリングの目的は、多様な特徴を捉えることであり、その一部はこれまで疾患や治療と関連付けられていなかった可能性がある³。その結果、プロファイリングにより、予期しない生物学的プロセスを明らかにすることができます。表現型プロファイリングは、通常、蛍光染色された細胞に依存しており、表現型プロファイルを作成するために、セルペインティングなどの標準化されたアッセイが開発されています⁴。最近では、表現型プロファイリングは、例えば、低分子の特性評価や、患者由来の線維芽細胞のみに基づくPDサブタイプの正確な予測に適用されています^5,6。これらの進歩にもかかわらず、表現型プロファイリングは、LRRK2 G2019SなどのPD関連変異を発現するヒト人工多能性幹細胞(iPSC)由来のmDAニューロンなど、有糸分裂後の分化細胞に適用されることはめったにありません。iPS細胞由来モデルの重要な課題には、分化バッチまたは遺伝子型にわたって微妙または可変の病理学的特徴が存在すること、および単離されたPD表現型が疾患の複雑さを完全に捉えていないという事実が含まれます。さらに、iPS細胞の神経モデルは生理学的に関連性があるが、技術的な複雑さが懸念されるため、PD創薬プロセスで使用されることはほとんどない^7,8。

私たちは以前、遺伝的および化合物による表現^{型の変化に}敏感なヒトmDAニューロンにおける複数のPD関連の病態生理学的表現型を測定するための堅牢な方法論を開発しました9。本稿では、mDAニューロンから表現型プロファイルを作成するために、この方法論をさらに最適化したバージョンについて詳しく説明します(図1)。このプロトコルには、高品質のmDAニューロンの使用や技術的な再現性など、前述の表現型プロファイリングアプローチに比べていくつかの利点があります。このプロトコルは、化学的摂動後の生理学的に関連する有糸分裂後mDAニューロンの表現型プロファイリングを、初めて拡張可能な方法で可能にします。完全に分化して凍結保存されたmDAニューロンが市販されており、バッチ間の分化のばらつきが大幅に減少しています。第二に、明確に定義された実験計画(培養期間やエッジウェルの回避など)、自動リキッドハンドリング、自動顕微鏡を使用することで、技術的なばらつきをさらに減らすことができます。さらに、教師なしクラスタリングまたは教師あり分類アプローチを使用した表現型プロファイル分析の最初のステップをここで概説し、表現型プロファイリングデータを分析する方法を示します。このプロトコルは、遺伝的または化学的摂動によって引き起こされるmDAニューロンの表現型の変化に関心のある研究者にとって、特に、スクリーニングキャンペーン中など、非常にスケーラブルな研究セットアップが必要な場合、または毒性作用を決定するために少数の化合物の効果を研究する場合などに使用されます。要約すると、ヒトニューロンの表現型プロファイリングの応用は、複雑な疾患関連の表現型を研究し、薬剤候補の細胞効果を特徴付けるための貴重な技術であると予想されます。

図1:ヒトiPS細胞由来のmDAニューロンから画像ベースの表現型プロファイルを生成するための実験プロトコルの概略図。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。