Profilage phénotypique des neurones dopaminergiques du mésencéphale dérivés de cellules souches humaines

Divers processus biologiques cellulaires sont perturbés dans la maladie de Parkinson (MP). Par exemple, un dysfonctionnement mitochondrial, un stress oxydatif, des défauts de dégradation des protéines, une perturbation du trafic vésiculaire et de la fonction endolysosomale ont été associés à une perte de neurones dopaminergiques du mésencéphale (mDA) sont couramment observés dans la MP¹. Par conséquent, la maladie de Parkinson semble impliquer de multiples mécanismes pathologiques qui peuvent interagir et s’aggraver mutuellement. Un moyen utile d’étudier cette interaction mécanistique est la création d’une empreinte phénotypique complète ou d’un profil des neurones dopaminergiques du mésencéphale (mDA).

Le profilage phénotypique est une approche qui consiste à créer un profil d’échantillon à partir d’un ensemble de caractéristiques mesurables, et deuxièmement, à faire des prédictions sur un échantillon en fonction de ce profil ^2,3. L’objectif du profilage est de saisir un large éventail de caractéristiques, dont certaines n’ont peut-être pas été associées auparavant à une maladie ou à un traitement³. Par conséquent, le profilage peut révéler des processus biologiques inattendus. Le profilage phénotypique repose généralement sur des cellules colorées par fluorescence, et des tests standardisés, tels que la peinture cellulaire, ont été développés pour créer des profils phénotypiques⁴. Récemment, le profilage phénotypique a, par exemple, été appliqué pour la caractérisation de petites molécules ou la prédiction précise de sous-types de MP uniquement sur la base de fibroblastes dérivés de patients ^5,6. Malgré ces avancées, le profilage phénotypique a rarement été appliqué aux cellules différenciées post-mitotiques, telles que les neurones mDA dérivés de cellules souches pluripotentes induites humaines (iPSC) qui expriment des mutations liées à la maladie de Parkinson telles que LRRK2 G2019S. Les défis importants des modèles dérivés des CSPi comprennent la présence de caractéristiques pathologiques subtiles ou variables entre les lots de différenciation ou les génotypes, et le fait que les phénotypes de MP isolés ne rendent pas compte de toute la complexité de la maladie. De plus, bien que les modèles neuronaux iPSC soient physiologiquement pertinents, ils sont rarement utilisés dans les processus de découverte de médicaments contre la maladie de Parkinson en raison de préoccupations liées à la complexité technique ^7,8.

Nous avons précédemment développé une méthodologie robuste pour mesurer plusieurs phénotypes physiopathologiques liés à la maladie de Parkinson dans les neurones mDA humains qui sont à la fois sensibles aux changements phénotypiques induits par les composés génétiques et chimiques⁹. Cet article décrit en détail une version optimisée de cette méthodologie pour créer des profils phénotypiques à partir de neurones mDA (Figure 1). Ce protocole présente plusieurs avantages par rapport aux approches de profilage phénotypique décrites précédemment, tels que l’utilisation de neurones mDA de haute qualité et la reproductibilité technique. Pour la première fois, ce protocole permet un profilage phénotypique dans les neurones mDA post-mitotiques physiologiquement pertinents après des perturbations chimiques de manière hautement évolutive. Des neurones mDA entièrement différenciés et cryoconservés sont disponibles dans le commerce, ce qui réduit considérablement la variabilité de la différenciation d’un lot à l’autre. Deuxièmement, la variabilité technique peut être encore réduite en utilisant un plan expérimental bien défini (c’est-à-dire la durée de la culture ou l’évitement des puits de bord), la manipulation automatisée des liquides et la microscopie automatisée. De plus, les étapes initiales de l’analyse du profil phénotypique à l’aide d’approches de classification ou de classification supervisées non supervisées sont décrites ici, indiquant comment les données de profilage phénotypique peuvent être analysées. Ce protocole sera utile aux chercheurs intéressés par les modifications phénotypiques des neurones mDA induites par des perturbations génétiques ou chimiques, en particulier lorsqu’un dispositif d’étude hautement évolutif est nécessaire, par exemple lors de campagnes de criblage ou lorsque les effets d’un plus petit nombre de composés doivent être étudiés, par exemple, pour déterminer les effets toxiques. En résumé, on s’attend à ce que l’application du profilage phénotypique des neurones humains soit une technique précieuse pour étudier les phénotypes complexes liés à des maladies et caractériser les effets cellulaires des candidats-médicaments.

Figure 1 : Représentation schématique du protocole expérimental de génération de profils phénotypiques basés sur l’image à partir de neurones mDA humains dérivés de CSPi. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.