Inmunofluorescencia dual de γH2AX y 53BP1 en linfocitos periféricos humanos
Summary
Este protocolo presenta un método para evaluar la formación y reparación de roturas de doble cadena de ADN mediante la detección simultánea de focos γH2AX y 53BP1 en núcleos interfase de linfocitos periféricos humanos tratados con bleomicina.
Abstract
Las roturas de doble cadena (DSB) son una de las lesiones más graves que pueden ocurrir en los núcleos celulares y, si no se reparan, pueden conducir a resultados graves, incluido el cáncer. Por lo tanto, la célula está provista de mecanismos complejos para reparar DSB, y estas vías involucran histona H2AX en su forma fosforilada en Ser-139 (es decir, γH2AX) y la proteína de unión a p53 1 (53BP1). Como ambas proteínas pueden formar focos en los sitios de los DSB, la identificación de estos marcadores se considera un método adecuado para estudiar tanto los DSB como su cinética de reparación. De acuerdo con los procesos moleculares que conducen a la formación de focos γH2AX y 53BP1, podría ser más útil investigar su colocalización cerca de los DSB para establecer un enfoque alternativo que permita cuantificar los DSB mediante la detección simultánea de dos marcadores de daño en el ADN. Así, este protocolo tiene como objetivo evaluar el daño genómico inducido en linfocitos humanos por el agente radiomimético bleomicina a través de la presencia de focos γH2AX y 53BP1 en una inmunofluorescencia dual. Usando esta metodología, también delineamos la variación en el número de focos γH2AX y 53BP1 a lo largo del tiempo, como un intento preliminar de estudiar la cinética de reparación de los DSB inducidos por bleomicina.
Introduction
El daño del ADN es inducido continuamente por agentes que pueden ser endógenos, como ROS generados por el metabolismo oxidativo celular, o exógenos, tanto químicos como físicos1. Entre las lesiones más dañinas, las roturas de doble cadena (DSB) juegan un papel fundamental para contribuir a la inestabilidad genómica, ya que causan aberraciones cromosómicas que a su vez pueden iniciar el proceso de carcinogénesis. Por lo tanto, las células están provistas de mecanismos complejos y eficientes de reparación de DSB2.
Cuando se produce un DSB, la célula desencadena la respuesta al daño del ADN (DDR) donde, junto con el complejo MRE11/RAD50/NBS1, se reclutan quinasas ATM o ATR para activar otras proteínas que ralentizan o detienen el ciclo celular3. Una diana esencial de estas quinasas es la histona H2AX, que se fosforila en Ser-139 dentro de unas pocas megabases de los DSB (a saber, γH2AX), lo que permite el reclutamiento de varios factores de reparación como, entre otros, BRCA1 y la proteína de unión a p53 1 (53BP1)3. Más tarde, se activa una vía entre la recombinación homóloga (HR), la unión final no homóloga (NHEJ) o el recocido de una sola hebra (SSA) para reparar los DSB 4,5. Por lo tanto, 53BP1 está involucrado en dictar la elección entre HR o NHEJ, promoviendo principalmente la activación de NHEJ en lugar de HR6. Además, tanto la forma fosforilada de la histona H2AX como la 53BP1 pueden formar focos en los sitios de los DSB. Como estos focos persisten hasta que se restaura la integridad de la doble cadena, la evaluación de la aparición/desaparición de focos γH2AX o 53BP1 dentro de un intervalo de tiempo se considera un método útil para evaluar la ocurrencia y reparación de DSB en un sistema celular 6,7. Sin embargo, de acuerdo con los procesos moleculares descritos anteriormente, dado que se espera que los focos γH2AX y 53BP1 se colocalicen cerca de los DSB durante la DDR8,9, puede ser útil detectar simultáneamente la presencia de estos marcadores en una inmunofluorescencia dual.
Por lo tanto, el objetivo de este manuscrito fue evaluar la idoneidad de la cuantificación simultánea de los focos γH2AX y 53BP1 para evaluar el daño genómico inducido en linfocitos periféricos humanos por el agente radiomimético bleomicina. Utilizando la misma metodología, también intentamos delinear la cinética de reparación de los DSB inducidos por bleomicina de acuerdo con un procedimiento experimental previamente establecido10.
Protocol
Representative Results
Discussion
El análisis de inmunofluorescencia de los focos γH2AX y 53BP1 es un método adecuado para evaluar el daño genómico en los núcleos de interfase de un sistema celular. Este procedimiento tiene varios puntos críticos que pueden afectar el resultado de los experimentos, principalmente, los agentes utilizados en la fijación y permeabilización, el tipo de anticuerpos y sus factores de dilución, y la concentración del mutágeno.
El mantenimiento de la integridad de las proteínas es fundame…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a todos los donantes de sangre y a todo el personal de salud que tomó las muestras de sangre.
Materials
| AlexaFluor 568 goat anti-mouse IgG (γ1) | Invitrogen | A21124 | 53BP1 secondary antibody |
| Bleoprim | Sanofi | bleomycin sulfate (mutagen) | |
| Penicillin-streptomycin solution 100X | Euroclone | ECB3001D | antibiotics for culture medium |
| PBS 10X | Termofisher | 14200075 | Phosphate-buffered saline |
| FBS | Euroclone | EC20180L | Fetal Bovine Serum for immunofluorescence |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) DyLight 488 Coniugated | Termofisher | #35552 | γH2AX secondary antibody |
| Mouse anti-53BP1 monoclonal antibody | Merck | MAB 3802 | 53BP1 primary antibody |
| Labophot 2 | Nikon | Fluorescence microscope | |
| P-histone H2AX (Ser139) rabbit antibody | Cell Signaling | #2577 | γH2AX primary antibody |
| Phytohemoagglutinin | Termofisher | R30852801 | component of culture medium |
| Prolong gold antifade reagent with DAPI | Cell Signaling | #8961 | Antifade solution with DAPI for counterstaining |
| RPMI 1640 | Euroclone | ECB9006L | Culture medium |
| Triton-X100 | Sigma | T9284 | Nonionic detergent for permeabilization |
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