Summary

Inmunofluorescencia dual de γH2AX y 53BP1 en linfocitos periféricos humanos

Published: July 14, 2023
doi:

Summary

Este protocolo presenta un método para evaluar la formación y reparación de roturas de doble cadena de ADN mediante la detección simultánea de focos γH2AX y 53BP1 en núcleos interfase de linfocitos periféricos humanos tratados con bleomicina.

Abstract

Las roturas de doble cadena (DSB) son una de las lesiones más graves que pueden ocurrir en los núcleos celulares y, si no se reparan, pueden conducir a resultados graves, incluido el cáncer. Por lo tanto, la célula está provista de mecanismos complejos para reparar DSB, y estas vías involucran histona H2AX en su forma fosforilada en Ser-139 (es decir, γH2AX) y la proteína de unión a p53 1 (53BP1). Como ambas proteínas pueden formar focos en los sitios de los DSB, la identificación de estos marcadores se considera un método adecuado para estudiar tanto los DSB como su cinética de reparación. De acuerdo con los procesos moleculares que conducen a la formación de focos γH2AX y 53BP1, podría ser más útil investigar su colocalización cerca de los DSB para establecer un enfoque alternativo que permita cuantificar los DSB mediante la detección simultánea de dos marcadores de daño en el ADN. Así, este protocolo tiene como objetivo evaluar el daño genómico inducido en linfocitos humanos por el agente radiomimético bleomicina a través de la presencia de focos γH2AX y 53BP1 en una inmunofluorescencia dual. Usando esta metodología, también delineamos la variación en el número de focos γH2AX y 53BP1 a lo largo del tiempo, como un intento preliminar de estudiar la cinética de reparación de los DSB inducidos por bleomicina.

Introduction

El daño del ADN es inducido continuamente por agentes que pueden ser endógenos, como ROS generados por el metabolismo oxidativo celular, o exógenos, tanto químicos como físicos1. Entre las lesiones más dañinas, las roturas de doble cadena (DSB) juegan un papel fundamental para contribuir a la inestabilidad genómica, ya que causan aberraciones cromosómicas que a su vez pueden iniciar el proceso de carcinogénesis. Por lo tanto, las células están provistas de mecanismos complejos y eficientes de reparación de DSB2.

Cuando se produce un DSB, la célula desencadena la respuesta al daño del ADN (DDR) donde, junto con el complejo MRE11/RAD50/NBS1, se reclutan quinasas ATM o ATR para activar otras proteínas que ralentizan o detienen el ciclo celular3. Una diana esencial de estas quinasas es la histona H2AX, que se fosforila en Ser-139 dentro de unas pocas megabases de los DSB (a saber, γH2AX), lo que permite el reclutamiento de varios factores de reparación como, entre otros, BRCA1 y la proteína de unión a p53 1 (53BP1)3. Más tarde, se activa una vía entre la recombinación homóloga (HR), la unión final no homóloga (NHEJ) o el recocido de una sola hebra (SSA) para reparar los DSB 4,5. Por lo tanto, 53BP1 está involucrado en dictar la elección entre HR o NHEJ, promoviendo principalmente la activación de NHEJ en lugar de HR6. Además, tanto la forma fosforilada de la histona H2AX como la 53BP1 pueden formar focos en los sitios de los DSB. Como estos focos persisten hasta que se restaura la integridad de la doble cadena, la evaluación de la aparición/desaparición de focos γH2AX o 53BP1 dentro de un intervalo de tiempo se considera un método útil para evaluar la ocurrencia y reparación de DSB en un sistema celular 6,7. Sin embargo, de acuerdo con los procesos moleculares descritos anteriormente, dado que se espera que los focos γH2AX y 53BP1 se colocalicen cerca de los DSB durante la DDR8,9, puede ser útil detectar simultáneamente la presencia de estos marcadores en una inmunofluorescencia dual.

Por lo tanto, el objetivo de este manuscrito fue evaluar la idoneidad de la cuantificación simultánea de los focos γH2AX y 53BP1 para evaluar el daño genómico inducido en linfocitos periféricos humanos por el agente radiomimético bleomicina. Utilizando la misma metodología, también intentamos delinear la cinética de reparación de los DSB inducidos por bleomicina de acuerdo con un procedimiento experimental previamente establecido10.

Protocol

El estudio fue aprobado por el comité de ética de la Universidad de Pisa, y se obtuvo el consentimiento informado y firmado de cada donante. 1. Formación de focos γH2AX y 53BP1 Preparación de muestras y tratamiento mutagénicoRecolectar muestras de sangre total por venopunción de individuos adultos sanos en tubos de recolección de sangre (por ejemplo, Vacutainer) que contienen heparina de litio como anticoagulante. Para garantizar l…

Representative Results

Los datos obtenidos por el análisis con microscopio de fluorescencia de linfocitos periféricos nos permiten evaluar tres aspectos principales: la efectividad del tratamiento con bleomicina para aumentar el número de focos de γH2AX y 53BP1 (y por lo tanto de DSB) debido a su efecto mutagénico, en qué medida ambos focos colocalizados en el sitio de los DSB, y el curso temporal de los focos de γH2AX y 53BP1 para delinear la cinética de reparación de los DSB inducidos por bleomicina. Como era de esperar, se observó…

Discussion

El análisis de inmunofluorescencia de los focos γH2AX y 53BP1 es un método adecuado para evaluar el daño genómico en los núcleos de interfase de un sistema celular. Este procedimiento tiene varios puntos críticos que pueden afectar el resultado de los experimentos, principalmente, los agentes utilizados en la fijación y permeabilización, el tipo de anticuerpos y sus factores de dilución, y la concentración del mutágeno.

El mantenimiento de la integridad de las proteínas es fundame…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a todos los donantes de sangre y a todo el personal de salud que tomó las muestras de sangre.

Materials

AlexaFluor 568 goat anti-mouse IgG (γ1) Invitrogen A21124 53BP1 secondary antibody
Bleoprim Sanofi bleomycin sulfate (mutagen)
Penicillin-streptomycin solution 100X Euroclone ECB3001D antibiotics for culture medium
PBS 10X Termofisher 14200075 Phosphate-buffered saline
FBS Euroclone EC20180L Fetal Bovine Serum for immunofluorescence
Goat anti-rabbit IgG (H+L) DyLight 488 Coniugated Termofisher #35552 γH2AX secondary antibody
Mouse anti-53BP1 monoclonal antibody Merck MAB 3802 53BP1 primary antibody
Labophot 2 Nikon Fluorescence microscope
P-histone H2AX (Ser139) rabbit antibody Cell Signaling #2577 γH2AX primary antibody
Phytohemoagglutinin Termofisher R30852801 component of culture medium
Prolong gold antifade reagent with DAPI Cell Signaling #8961 Antifade solution with DAPI for counterstaining
RPMI 1640 Euroclone ECB9006L Culture medium
Triton-X100 Sigma T9284 Nonionic detergent for permeabilization

References

  1. Chatterjee, N., Walker, G. C. Mechanisms of DNA damage, repair and mutagenesis. Environmental and Molecular Mutagenesis. 58 (5), 235-263 (2017).
  2. Aleksandrov, R., Hristova, R., Stoynov, S., Gospodinov, A. The chromatin response to double-strand DNA breaks and their repair. Cells. 9 (8), 1853 (2020).
  3. Jackson, S. P., Bartek, J. The DNA-damage response in human biology and disease. Nature. 461 (7267), 1071-1078 (2009).
  4. Dickey, J. S., et al. H2AX: functional roles and potential applications. Chromosoma. 118 (6), 683-692 (2009).
  5. Her, J., Bunting, S. F. How cells ensure correct repair of DNA double-strand break. Journal of Biological Chemistry, Thematic Minireview. 293 (27), 10502-10511 (2018).
  6. Kuo, L. K., Yang, L. γ-H2AX – A novel biomarker for DNA double-strand breaks. In Vivo. 22 (3), 305-310 (2008).
  7. Bártová, E., Legartova, S., Dundr, M., Suchánková, J. A role of the 53BP1 protein in genome protection: structural and functional characteristics of 53BP1-dependent DNA repair. Aging. 11 (8), 2488-2511 (2019).
  8. Popp, H. D., Brendel, S., Hofman, W., Fabarius, A. Immunofluorescence microscopy of γH2AX and 53BP1 for analyzing the formation and repair of DNA double-strand breaks. Journal of Visualized Experiments. (129), 56617 (2017).
  9. Jezkova, L., et al. Particles with similar LET values generate DNA breaks of different complexity and reparability: a high-resolution microscopy analysis of γH2AX/53BP1 foci. Nanoscale. 10, 1162-1179 (2018).
  10. Scarpato, R., et al. Kinetics of nuclear phosphorylation (γ-H2AX) in human lymphocytes treated in vitro with UVB, bleomycin and mitomycin C. Mutagenesis. 28 (4), 465-473 (2013).
  11. Im, K., Mareninov, S., Diaz, M. F. P., Yong, W. H. An introduction to performing immunofluorescence staining. Methods in Molecular Biology. 1897, 299-311 (2019).
  12. Sanderson, M. J., Smith, I., Parker, I., Bootman, M. D. . Fluorescence microscopy. 10, (2014).
  13. Jamur, M. C., Oliver, C. Cell fixatives for immunostaining. Methods in Molecular Biology. , 55-61 (2010).
  14. Jamur, M. C., Oliver, C. Permeabilization of the cell membrane. Methods in Molecular Biology. 588, 63-66 (2010).
  15. Hecht, S. M. Bleomycin: New perspectives on the mechanism of action. Journal of Natural Products. 63, 158-168 (2000).
  16. Fei, P., El-Deiry, W. S. P53 and radiation responses. Oncogene. 22, 5774-5783 (2003).
  17. Mahaney, B. L., Meek, K., Lees-Miller, S. L. Repair of ionizing radiation-induced DNA double-strand breaks by non-homologous end-joining. Biochemical Journal. 417 (3), 639-650 (2009).
  18. Palla, V., et al. Gamma-H2AX: Can it be established as a classical cancer prognostic factor. Tumor Biology. 39 (3), 1010428317695931 (2017).
  19. Markovà, E., Hillert, L., Malmgren, L., Persson, B. R. R., Belyaev, I. Y. Microwaves from GSM mobile telephones affect 53BP1 and gamma-H2AX foci in human lymphocytes from hypersensitive and healthy persons. Environmental Health Perspectives. 113 (9), 1172-1177 (2005).
  20. Scarpato, R., et al. Nuclear damage in peripheral lymphocytes of obese and overweight Italian children as evaluated by the γ-H2AX focus assay and micronucleus test. The FASEB Journal. 25 (2), 685-693 (2018).
  21. Shanbhag, N. M., et al. Early neuronal accumulation of DNA double-strand breaks in Alzheimer’s disease. Acta Neuropathologica Communication. 7 (1), 77 (2019).
  22. Lassmann, M., et al. In vivo formation of gamma-H2AX and 53BP1 DNA repair foci in blood cells after radioiodine therapy of differentiated thyroid cancer. Journal of Nuclear Medicine. 51 (8), 1318-1325 (2010).
  23. Derlin, T., et al. Assessment of γ-H2AX and 53BP1 foci in peripheral blood lymphocytes to predict subclinical hematotoxicity and response in somatostatin receptor-targeted radionuclide therapy for advanced gastroenteropancreatic neuroendocrine tumors. Cancers (Basel). 13 (7), 1516 (2021).
  24. Djuzenova, C. S., et al. Radiosensitivity in breast cancer assessed by the histone γ-H2AX and 53BP1 foci. Radiation Oncology. 24, 8-98 (2013).
  25. Atkinson, J., Bezak, E., Kempson, I. Imaging DNA double-strand breaks – are we there yet. Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 23, 579-580 (2022).

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Cite This Article
Falaschi, A., Chiaramonte, A., Testi, S., Scarpato, R. Dual Immunofluorescence of γH2AX and 53BP1 in Human Peripheral Lymphocytes. J. Vis. Exp. (197), e65472, doi:10.3791/65472 (2023).

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