Summary

التألق المناعي المزدوج ل γH2AX و 53BP1 في الخلايا الليمفاوية المحيطية البشرية

Published: July 14, 2023
doi:

Summary

يقدم هذا البروتوكول طريقة لتقييم تكوين وإصلاح فواصل الحمض النووي المزدوجة من خلال الكشف المتزامن عن بؤر γH2AX و 53BP1 في نوى الطور البيني للخلايا الليمفاوية الطرفية البشرية المعالجة بالبليوميسين.

Abstract

تعد فواصل الخيوط المزدوجة (DSBs) واحدة من أشد الآفات التي يمكن أن تحدث في نوى الخلية ، وإذا لم يتم إصلاحها ، فقد تؤدي إلى نتائج خطيرة ، بما في ذلك السرطان. لذلك ، يتم تزويد الخلية بآليات معقدة لإصلاح DSBs ، وتتضمن هذه المسارات هيستون H2AX في شكله المفسفر في Ser-139 (أي γH2AX) وبروتين ربط p53 1 (53BP1). نظرا لأن كلا البروتينين يمكن أن يشكلان بؤرا في مواقع DSBs ، فإن تحديد هذه العلامات يعتبر طريقة مناسبة لدراسة كل من DSBs وحركية إصلاحها. وفقا للعمليات الجزيئية التي تؤدي إلى تكوين بؤر γH2AX و 53BP1 ، قد يكون من المفيد أكثر التحقيق في توطينها المشترك بالقرب من DSBs من أجل إعداد نهج بديل يسمح بقياس DSBs عن طريق الكشف المتزامن عن علامتين لتلف الحمض النووي. وبالتالي ، يهدف هذا البروتوكول إلى تقييم الضرر الجينومي الناجم في الخلايا الليمفاوية البشرية بواسطة عامل المحاكاة الإشعاعية بليوميسين من خلال وجود بؤر γH2AX و 53BP1 في تألق مناعي مزدوج. باستخدام هذه المنهجية ، حددنا أيضا التباين في عدد بؤر γH2AX و 53BP1 بمرور الوقت ، كمحاولة أولية لدراسة حركية الإصلاح ل DSBs التي يسببها بليوميسين.

Introduction

يحدث تلف الحمض النووي باستمرار بواسطة عوامل يمكن أن تكون داخلية المنشأ ، مثل أنواع الأكسجين التفاعلية الناتجة عن التمثيل الغذائي التأكسدي الخلوي ، أو الخارجية ، سواء المواد الكيميائية أو الفيزيائية1. من بين الآفات الأكثر ضررا ، تلعب فواصل الخيوط المزدوجة (DSBs) دورا أساسيا في المساهمة في عدم الاستقرار الجيني ، لأنها تسبب انحرافات الكروموسومات التي بدورها يمكن أن تبدأ عملية التسرطن. وبالتالي ، يتم تزويد الخلايا بآليات معقدة وفعالة لإصلاح DSBs2.

عندما يحدث DSB ، تقوم الخلية بتشغيل استجابة تلف الحمض النووي (DDR) حيث ، جنبا إلى جنب مع مركب MRE11 / RAD50 / NBS1 ، يتم تجنيد كينازات ATM أو ATR لتنشيط البروتينات الأخرى التي تبطئ أو توقف دورة الخلية3. الهدف الأساسي لهذه الكينازات هو هيستون H2AX ، الذي يتم فسفرته على Ser-139 ضمن عدد قليل من القواعد الضخمة من DSBs (أي γH2AX) ، مما يسمح بتوظيف العديد من عوامل الإصلاح مثل ، من بين أمور أخرى ، BRCA1 و p53 بروتين الربط 1 (53BP1) 3. في وقت لاحق ، يتم تشغيل مسار واحد بين إعادة التركيب المتماثل (HR) ، أو الانضمام النهائي غير المتماثل (NHEJ) ، أو التلدين أحادي الشريط (SSA) لإصلاح DSBs 4,5. لذلك ، تشارك 53BP1 في إملاء الاختيار بين HR أو NHEJ ، مما يعزز بشكل أساسي تنشيط NHEJ بدلا من HR6. علاوة على ذلك ، يمكن أن يشكل كل من الشكل المفسفر لهستون H2AX و 53BP1 بؤرا في مواقع DSBs. مع استمرار هذه البؤر حتى يتم استعادة سلامة الشريط المزدوج ، يعتبر تقييم مظهر / اختفاء بؤر γH2AX أو 53BP1 خلال فترة زمنية طريقة مفيدة لتقييم حدوث وإصلاح DSBs في نظام الخلية 6,7. ومع ذلك ، وفقا للعمليات الجزيئية الموصوفة أعلاه ، نظرا لأنه من المتوقع أن تتركز بؤر γH2AX و 53BP1 بالقرب من DSBs خلال DDR 8,9 ، فقد يكون من المفيد الكشف بشكل متزامن عن وجود هذه العلامات في تألق مناعي مزدوج.

وبالتالي ، كان الهدف من هذه المخطوطة هو تقييم مدى ملاءمة القياس الكمي المتزامن لبؤر γH2AX و 53BP1 لتقييم الضرر الجيني الناجم في الخلايا الليمفاوية المحيطية البشرية بواسطة عامل المحاكاة الإشعاعية بليوميسين. باستخدام نفس المنهجية ، حاولنا أيضا تحديد حركية الإصلاح ل DSBs التي يسببها بليوميسين وفقا لإجراء تجريبي تم إعداده مسبقا10.

Protocol

تمت الموافقة على الدراسة من قبل اللجنة الأخلاقية بجامعة بيزا ، وتم الحصول على موافقة مستنيرة وموقعة من كل متبرع. 1. تشكيل بؤر γH2AX و 53BP1 تحضير العينات وعلاج الطفراتجمع عينات الدم الكامل عن طريق بزل الوريد من الأفراد البالغين الأصحاء في أنابيب جمع الدم (على <e…

Representative Results

تسمح لنا البيانات التي تم الحصول عليها بواسطة تحليل المجهر الفلوري للخلايا الليمفاوية المحيطية بتقييم ثلاثة جوانب رئيسية: فعالية علاج بليوميسين في زيادة عدد بؤر γH2AX و 53BP1 (وبالتالي DSBs) بسبب تأثيره المطفر ، وإلى أي مدى تركزت كل من البؤر في موقع DSBs ، والمسار الزمني لبؤر γH2AX و 53BP1 لتحديد حركية …

Discussion

يعد تحليل التألق المناعي لبؤر γH2AX و 53BP1 طريقة مناسبة لتقييم الضرر الجيني في نوى الطور البيني لنظام الخلية. يحتوي هذا الإجراء على العديد من النقاط الحرجة التي يمكن أن تؤثر على نتائج التجارب ، بشكل أساسي ، العوامل المستخدمة في التثبيت والنفاذية ، ونوع الأجسام المضادة وعوامل تخفيفها ، وتركيز…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ونحن ممتنون للمتبرعين بالدم بالكامل ولجميع العاملين الصحيين الذين أخذوا عينات الدم.

Materials

AlexaFluor 568 goat anti-mouse IgG (γ1) Invitrogen A21124 53BP1 secondary antibody
Bleoprim Sanofi bleomycin sulfate (mutagen)
Penicillin-streptomycin solution 100X Euroclone ECB3001D antibiotics for culture medium
PBS 10X Termofisher 14200075 Phosphate-buffered saline
FBS Euroclone EC20180L Fetal Bovine Serum for immunofluorescence
Goat anti-rabbit IgG (H+L) DyLight 488 Coniugated Termofisher #35552 γH2AX secondary antibody
Mouse anti-53BP1 monoclonal antibody Merck MAB 3802 53BP1 primary antibody
Labophot 2 Nikon Fluorescence microscope
P-histone H2AX (Ser139) rabbit antibody Cell Signaling #2577 γH2AX primary antibody
Phytohemoagglutinin Termofisher R30852801 component of culture medium
Prolong gold antifade reagent with DAPI Cell Signaling #8961 Antifade solution with DAPI for counterstaining
RPMI 1640 Euroclone ECB9006L Culture medium
Triton-X100 Sigma T9284 Nonionic detergent for permeabilization

References

  1. Chatterjee, N., Walker, G. C. Mechanisms of DNA damage, repair and mutagenesis. Environmental and Molecular Mutagenesis. 58 (5), 235-263 (2017).
  2. Aleksandrov, R., Hristova, R., Stoynov, S., Gospodinov, A. The chromatin response to double-strand DNA breaks and their repair. Cells. 9 (8), 1853 (2020).
  3. Jackson, S. P., Bartek, J. The DNA-damage response in human biology and disease. Nature. 461 (7267), 1071-1078 (2009).
  4. Dickey, J. S., et al. H2AX: functional roles and potential applications. Chromosoma. 118 (6), 683-692 (2009).
  5. Her, J., Bunting, S. F. How cells ensure correct repair of DNA double-strand break. Journal of Biological Chemistry, Thematic Minireview. 293 (27), 10502-10511 (2018).
  6. Kuo, L. K., Yang, L. γ-H2AX – A novel biomarker for DNA double-strand breaks. In Vivo. 22 (3), 305-310 (2008).
  7. Bártová, E., Legartova, S., Dundr, M., Suchánková, J. A role of the 53BP1 protein in genome protection: structural and functional characteristics of 53BP1-dependent DNA repair. Aging. 11 (8), 2488-2511 (2019).
  8. Popp, H. D., Brendel, S., Hofman, W., Fabarius, A. Immunofluorescence microscopy of γH2AX and 53BP1 for analyzing the formation and repair of DNA double-strand breaks. Journal of Visualized Experiments. (129), 56617 (2017).
  9. Jezkova, L., et al. Particles with similar LET values generate DNA breaks of different complexity and reparability: a high-resolution microscopy analysis of γH2AX/53BP1 foci. Nanoscale. 10, 1162-1179 (2018).
  10. Scarpato, R., et al. Kinetics of nuclear phosphorylation (γ-H2AX) in human lymphocytes treated in vitro with UVB, bleomycin and mitomycin C. Mutagenesis. 28 (4), 465-473 (2013).
  11. Im, K., Mareninov, S., Diaz, M. F. P., Yong, W. H. An introduction to performing immunofluorescence staining. Methods in Molecular Biology. 1897, 299-311 (2019).
  12. Sanderson, M. J., Smith, I., Parker, I., Bootman, M. D. . Fluorescence microscopy. 10, (2014).
  13. Jamur, M. C., Oliver, C. Cell fixatives for immunostaining. Methods in Molecular Biology. , 55-61 (2010).
  14. Jamur, M. C., Oliver, C. Permeabilization of the cell membrane. Methods in Molecular Biology. 588, 63-66 (2010).
  15. Hecht, S. M. Bleomycin: New perspectives on the mechanism of action. Journal of Natural Products. 63, 158-168 (2000).
  16. Fei, P., El-Deiry, W. S. P53 and radiation responses. Oncogene. 22, 5774-5783 (2003).
  17. Mahaney, B. L., Meek, K., Lees-Miller, S. L. Repair of ionizing radiation-induced DNA double-strand breaks by non-homologous end-joining. Biochemical Journal. 417 (3), 639-650 (2009).
  18. Palla, V., et al. Gamma-H2AX: Can it be established as a classical cancer prognostic factor. Tumor Biology. 39 (3), 1010428317695931 (2017).
  19. Markovà, E., Hillert, L., Malmgren, L., Persson, B. R. R., Belyaev, I. Y. Microwaves from GSM mobile telephones affect 53BP1 and gamma-H2AX foci in human lymphocytes from hypersensitive and healthy persons. Environmental Health Perspectives. 113 (9), 1172-1177 (2005).
  20. Scarpato, R., et al. Nuclear damage in peripheral lymphocytes of obese and overweight Italian children as evaluated by the γ-H2AX focus assay and micronucleus test. The FASEB Journal. 25 (2), 685-693 (2018).
  21. Shanbhag, N. M., et al. Early neuronal accumulation of DNA double-strand breaks in Alzheimer’s disease. Acta Neuropathologica Communication. 7 (1), 77 (2019).
  22. Lassmann, M., et al. In vivo formation of gamma-H2AX and 53BP1 DNA repair foci in blood cells after radioiodine therapy of differentiated thyroid cancer. Journal of Nuclear Medicine. 51 (8), 1318-1325 (2010).
  23. Derlin, T., et al. Assessment of γ-H2AX and 53BP1 foci in peripheral blood lymphocytes to predict subclinical hematotoxicity and response in somatostatin receptor-targeted radionuclide therapy for advanced gastroenteropancreatic neuroendocrine tumors. Cancers (Basel). 13 (7), 1516 (2021).
  24. Djuzenova, C. S., et al. Radiosensitivity in breast cancer assessed by the histone γ-H2AX and 53BP1 foci. Radiation Oncology. 24, 8-98 (2013).
  25. Atkinson, J., Bezak, E., Kempson, I. Imaging DNA double-strand breaks – are we there yet. Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 23, 579-580 (2022).

Play Video

Cite This Article
Falaschi, A., Chiaramonte, A., Testi, S., Scarpato, R. Dual Immunofluorescence of γH2AX and 53BP1 in Human Peripheral Lymphocytes. J. Vis. Exp. (197), e65472, doi:10.3791/65472 (2023).

View Video