אימונופלואורסנציה כפולה של γH2AX ו- 53BP1 בלימפוציטים היקפיים אנושיים
Summary
פרוטוקול זה מציג שיטה להערכת היווצרות ותיקון של פריצות דו-גדילי DNA באמצעות זיהוי סימולטני של מוקדי γH2AX ו-53BP1 בגרעינים בין-פאזיים של לימפוציטים היקפיים אנושיים שטופלו בבלומיצין.
Abstract
שברי גדיל כפול (DSB) הם אחד הנגעים החמורים ביותר שיכולים להתרחש בגרעין התא, ואם לא יתוקנו, הם יכולים להוביל לתוצאות חמורות, כולל סרטן. התא, אם כן, מסופק עם מנגנונים מורכבים לתיקון DSBs, ומסלולים אלה כוללים היסטון H2AX בצורתו הזרחנית ב- Ser-139 (כלומר γH2AX) וחלבון קושר p53 1 (53BP1). מכיוון ששני החלבונים יכולים ליצור מוקדים באתרי DSBs, זיהוי סמנים אלה נחשב לשיטה מתאימה לחקור הן את DSB והן את קינטיקה התיקון שלהם. על פי התהליכים המולקולריים המובילים להיווצרות מוקדי γH2AX ו-53BP1, זה יכול להיות שימושי יותר לחקור את הלוקליזציה המשותפת שלהם ליד ה-DSB על מנת להקים גישה חלופית המאפשרת לכמת DSB על ידי זיהוי סימולטני של שני סמני נזק לדנ”א. לפיכך, פרוטוקול זה נועד להעריך את הנזק הגנומי הנגרם בלימפוציטים אנושיים על ידי הסוכן הרדיומימטי בלומיצין באמצעות נוכחות של מוקדי γH2AX ו- 53BP1 באימונופלואורסנציה כפולה. באמצעות מתודולוגיה זו, תיארנו גם את השונות במספר מוקדי γH2AX ו-53BP1 לאורך זמן, כניסיון ראשוני לחקור את קינטיקה התיקון של DSB המושרה על ידי בלומיצין.
Introduction
נזק לדנ”א נגרם באופן מתמשך על ידי חומרים שיכולים להיות אנדוגניים, כגון ROS שנוצר על ידי מטבוליזם חמצוני תאי, או אקסוגני, הן כימיקלים והן פיזיים1. בין הנגעים המזיקים ביותר, שברים דו-גדיליים (DSB) ממלאים תפקיד בסיסי בתרומה לאי יציבות גנומית, שכן הם גורמים לסטיות כרומוזומים שבתורן יכולות להתחיל את תהליך הקרצינוגנזה. לפיכך, תאים מסופקים עם מנגנונים מורכבים ויעילים של DSB תיקון2.
כאשר DSB מתרחש, התא מפעיל את תגובת הנזק לדנ”א (DDR) שבה, יחד עם קומפלקס MRE11/RAD50/NBS1, קינאזות ATM או ATR מגויסות כדי להפעיל חלבונים אחרים שמאטים או עוצרים את מחזור התא3. מטרה חיונית של קינאזות אלה היא היסטון H2AX, אשר פוספורילציה על Ser-139 בתוך כמה מגה-בסיסים מן DSB (כלומר γH2AX), ובכך מאפשר גיוס של מספר גורמי תיקון כגון, בין היתר, BRCA1 ו p53 קושר חלבון 1 (53BP1)3. מאוחר יותר, מסלול אחד בין רקומבינציה הומולוגית (HR), חיבור קצה לא הומולוגי (NHEJ), או חישול חד-גדילי (SSA) מופעל כדי לתקן את DSBs 4,5. לכן, 53BP1 מעורב בהכתבת הבחירה בין HR או NHEJ, בעיקר קידום ההפעלה של NHEJ ולא HR6. יתר על כן, הן הצורה הזרחנית של היסטון H2AX והן 53BP1 יכולות ליצור מוקדים באתרי DSB. מכיוון שמוקדים אלה נמשכים עד לשחזור שלמות הגדיל הכפול, הערכת המראה / היעלמות של מוקדי γH2AX או 53BP1 במרווח זמן נחשבת לשיטה שימושית להערכת המופע והתיקון של DSB במערכת התא 6,7. עם זאת, על פי התהליכים המולקולריים שתוארו לעיל, מכיוון שמוקדי γH2AX ו- 53BP1 צפויים להתמקם יחד ליד ה- DSB במהלך DDR8,9, זה יכול להיות שימושי לזהות בו זמנית את נוכחותם של סמנים אלה באימונופלואורסנציה כפולה.
לפיכך, מטרת כתב היד הייתה להעריך את התאמתם של מוקדי γH2AX ו-53BP1 בו זמנית כדי להעריך את הנזק הגנומי שנגרם בלימפוציטים היקפיים אנושיים על ידי הסוכן הרדיומימטי בלומיצין. באמצעות אותה מתודולוגיה, ניסינו גם להגדיר קינטיקה של תיקון של DSB המושרה על ידי בלומיצין על פי הליך ניסיוני10 שהוקם בעבר.
Protocol
Representative Results
Discussion
ניתוח אימונופלואורסנציה של מוקדי γH2AX ו-53BP1 הוא שיטה מתאימה להערכת נזק גנומי בגרעינים בין-פאזיים של מערכת תאים. הליך זה יש כמה נקודות קריטיות שיכולות להשפיע על התוצאה של הניסויים, בעיקר, הסוכנים המשמשים קיבוע וחדירה, סוג הנוגדנים וגורמי דילול שלהם, ואת ריכוז של mutagen.
שמירה על ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו אסירי תודה לכל תורמי הדם ולכל אנשי הצוות הרפואי שלקחו את דגימות הדם.
Materials
| AlexaFluor 568 goat anti-mouse IgG (γ1) | Invitrogen | A21124 | 53BP1 secondary antibody |
| Bleoprim | Sanofi | bleomycin sulfate (mutagen) | |
| Penicillin-streptomycin solution 100X | Euroclone | ECB3001D | antibiotics for culture medium |
| PBS 10X | Termofisher | 14200075 | Phosphate-buffered saline |
| FBS | Euroclone | EC20180L | Fetal Bovine Serum for immunofluorescence |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) DyLight 488 Coniugated | Termofisher | #35552 | γH2AX secondary antibody |
| Mouse anti-53BP1 monoclonal antibody | Merck | MAB 3802 | 53BP1 primary antibody |
| Labophot 2 | Nikon | Fluorescence microscope | |
| P-histone H2AX (Ser139) rabbit antibody | Cell Signaling | #2577 | γH2AX primary antibody |
| Phytohemoagglutinin | Termofisher | R30852801 | component of culture medium |
| Prolong gold antifade reagent with DAPI | Cell Signaling | #8961 | Antifade solution with DAPI for counterstaining |
| RPMI 1640 | Euroclone | ECB9006L | Culture medium |
| Triton-X100 | Sigma | T9284 | Nonionic detergent for permeabilization |
References
- Chatterjee, N., Walker, G. C. Mechanisms of DNA damage, repair and mutagenesis. Environmental and Molecular Mutagenesis. 58 (5), 235-263 (2017).
- Aleksandrov, R., Hristova, R., Stoynov, S., Gospodinov, A. The chromatin response to double-strand DNA breaks and their repair. Cells. 9 (8), 1853 (2020).
- Jackson, S. P., Bartek, J. The DNA-damage response in human biology and disease. Nature. 461 (7267), 1071-1078 (2009).
- Dickey, J. S., et al. H2AX: functional roles and potential applications. Chromosoma. 118 (6), 683-692 (2009).
- Her, J., Bunting, S. F. How cells ensure correct repair of DNA double-strand break. Journal of Biological Chemistry, Thematic Minireview. 293 (27), 10502-10511 (2018).
- Kuo, L. K., Yang, L. γ-H2AX – A novel biomarker for DNA double-strand breaks. In Vivo. 22 (3), 305-310 (2008).
- Bártová, E., Legartova, S., Dundr, M., Suchánková, J. A role of the 53BP1 protein in genome protection: structural and functional characteristics of 53BP1-dependent DNA repair. Aging. 11 (8), 2488-2511 (2019).
- Popp, H. D., Brendel, S., Hofman, W., Fabarius, A. Immunofluorescence microscopy of γH2AX and 53BP1 for analyzing the formation and repair of DNA double-strand breaks. Journal of Visualized Experiments. (129), 56617 (2017).
- Jezkova, L., et al. Particles with similar LET values generate DNA breaks of different complexity and reparability: a high-resolution microscopy analysis of γH2AX/53BP1 foci. Nanoscale. 10, 1162-1179 (2018).
- Scarpato, R., et al. Kinetics of nuclear phosphorylation (γ-H2AX) in human lymphocytes treated in vitro with UVB, bleomycin and mitomycin C. Mutagenesis. 28 (4), 465-473 (2013).
- Im, K., Mareninov, S., Diaz, M. F. P., Yong, W. H. An introduction to performing immunofluorescence staining. Methods in Molecular Biology. 1897, 299-311 (2019).
- Sanderson, M. J., Smith, I., Parker, I., Bootman, M. D. . Fluorescence microscopy. 10, (2014).
- Jamur, M. C., Oliver, C. Cell fixatives for immunostaining. Methods in Molecular Biology. , 55-61 (2010).
- Jamur, M. C., Oliver, C. Permeabilization of the cell membrane. Methods in Molecular Biology. 588, 63-66 (2010).
- Hecht, S. M. Bleomycin: New perspectives on the mechanism of action. Journal of Natural Products. 63, 158-168 (2000).
- Fei, P., El-Deiry, W. S. P53 and radiation responses. Oncogene. 22, 5774-5783 (2003).
- Mahaney, B. L., Meek, K., Lees-Miller, S. L. Repair of ionizing radiation-induced DNA double-strand breaks by non-homologous end-joining. Biochemical Journal. 417 (3), 639-650 (2009).
- Palla, V., et al. Gamma-H2AX: Can it be established as a classical cancer prognostic factor. Tumor Biology. 39 (3), 1010428317695931 (2017).
- Markovà, E., Hillert, L., Malmgren, L., Persson, B. R. R., Belyaev, I. Y. Microwaves from GSM mobile telephones affect 53BP1 and gamma-H2AX foci in human lymphocytes from hypersensitive and healthy persons. Environmental Health Perspectives. 113 (9), 1172-1177 (2005).
- Scarpato, R., et al. Nuclear damage in peripheral lymphocytes of obese and overweight Italian children as evaluated by the γ-H2AX focus assay and micronucleus test. The FASEB Journal. 25 (2), 685-693 (2018).
- Shanbhag, N. M., et al. Early neuronal accumulation of DNA double-strand breaks in Alzheimer’s disease. Acta Neuropathologica Communication. 7 (1), 77 (2019).
- Lassmann, M., et al. In vivo formation of gamma-H2AX and 53BP1 DNA repair foci in blood cells after radioiodine therapy of differentiated thyroid cancer. Journal of Nuclear Medicine. 51 (8), 1318-1325 (2010).
- Derlin, T., et al. Assessment of γ-H2AX and 53BP1 foci in peripheral blood lymphocytes to predict subclinical hematotoxicity and response in somatostatin receptor-targeted radionuclide therapy for advanced gastroenteropancreatic neuroendocrine tumors. Cancers (Basel). 13 (7), 1516 (2021).
- Djuzenova, C. S., et al. Radiosensitivity in breast cancer assessed by the histone γ-H2AX and 53BP1 foci. Radiation Oncology. 24, 8-98 (2013).
- Atkinson, J., Bezak, E., Kempson, I. Imaging DNA double-strand breaks – are we there yet. Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 23, 579-580 (2022).
