Análisis automatizado optimizado de la modulación de la homeostasis de las mitocondrias neuronales vivas mediante receptores de ácido retinoico específicos de isoformas
Summary
La red mitocondrial es extremadamente compleja, lo que hace que sea muy difícil de analizar. Una novedosa herramienta de MATLAB analiza mitocondrias con imágenes confocales en vivo en imágenes timelapse, pero da como resultado un gran volumen de salida que requiere atención manual individual. Para solucionar este problema, se desarrolló una optimización de rutina que permite un análisis rápido de los archivos.
Abstract
La compleja red mitocondrial hace que sea muy difícil segmentar, seguir y analizar las células vivas. Las herramientas de MATLAB permiten el análisis de mitocondrias en archivos timelapse, simplificando y agilizando considerablemente el proceso de procesamiento de imágenes. No obstante, las herramientas existentes producen un gran volumen de salida, lo que requiere atención manual individual, y las configuraciones experimentales básicas tienen una salida de miles de archivos, cada uno de los cuales requiere un manejo extenso y lento.
Para abordar estos problemas, se desarrolló una optimización rutinaria, tanto en código de MATLAB como en forma de scripts en vivo, lo que permite un análisis rápido de archivos y reduce significativamente la lectura de documentos y el procesamiento de datos. Con una velocidad de 100 archivos/min, la optimización permite un análisis rápido en general. La optimización logra la salida de resultados promediando los datos específicos del marco para las mitocondrias individuales a lo largo de los marcos de tiempo, analizando los datos de una manera definida, consistente con la salida de las herramientas existentes. Se realizaron imágenes confocales en vivo utilizando el colorante tetrametilrodamina metil éster, y la optimización de rutina se validó mediante el tratamiento de células neuronales con agonistas del receptor de ácido retinoico (RAR), cuyos efectos sobre las mitocondrias neuronales están establecidos en la literatura. Los resultados fueron consistentes con la literatura y permitieron una mayor caracterización del comportamiento de la red mitocondrial en respuesta a la modulación de RAR específica de isoformas.
Esta nueva metodología permitió una caracterización rápida y validada de la red de mitocondrias de toda la neurona, pero también permite la diferenciación entre las mitocondrias axónicas y las del cuerpo celular, una característica esencial para aplicar en el campo de la neurociencia. Además, este protocolo se puede aplicar a experimentos que utilizan tratamientos de acción rápida, permitiendo la obtención de imágenes de las mismas células antes y después de los tratamientos, trascendiendo el campo de la neurociencia.
Introduction
Las mitocondrias celulares se encuentran en el centro de todos los estados fisiológicos, y una comprensión profunda de su homeostasis (mitástasis) y comportamiento es primordial para ayudar a identificar el tratamiento farmacológico para una amplia gama de enfermedades, incluyendo el cáncer y la enfermedad de Alzheimer 1,2.
Las mitocondrias desempeñan un papel celular crucial en la homeostasis energética, la generación de ATP, la amortiguación del calcio y la regulación de ROS, y la mitostasis es esencial para mantener la homeostasis de las proteínas, ya que las chaperonas moleculares dependen de la energía3. Estos requieren una modulación y adaptación de red constante y dinámica para satisfacer eficientemente las necesidades celulares, y el transporte de mitocondrias está regulado por diferentes vías de señalización; Trabajos previos han descrito una de estas vías, la de los receptores de ácido retinoico (RARs)4,5. El ácido retinoico (AR) promueve el crecimiento axonal y de neuritas a través de la activación de RAR. En las neuronas corticales primarias de ratón, la activación de RAR-β estimula el crecimiento, la velocidad y la movilidad mitocondrial en la neurita6.
Teniendo en cuenta la adaptabilidad y la dinámica de la red mitocondrial, la posibilidad de evaluar la mitostasis en “tiempo real” es esencial no solo para investigar la homeostasis energética, sino también para la proteostasis, la salud celular, la proliferación o la señalización. Un método comúnmente utilizado para evaluar la mitostasis se basa en la microscopía confocal después de resaltar las mitocondrias utilizando un colorante o marcador fluorescente, así como una configuración de microscopía específica que permite la regulación de la temperatura y/o elCO2 7. Este tipo de configuración experimental implica que se realice una réplica experimental a la vez. Además de la repetición experimental de diferentes tratamientos, se debe considerar que la mayoría de los experimentos deben tener sus réplicas técnicas (donde se visualiza más de una posición por placa), con una serie de planos focales (pilas z) que se registran en una serie de puntos de tiempo. Así, un diseño experimental con tres repeticiones de un control y dos tratamientos, con cinco posiciones de imagen por placa, y 15 puntos de tiempo, da como resultado 225 pilas a procesar. Clásicamente, los videos de mitocondrias vivas se analizaban mediante el trazado de quimógrafos, que se analizaban individualmente8, en un proceso que consumía mucho tiempo y que requería una amplia entrada manual, incluso cuando se dependía de herramientas informáticas.
Recientemente se ha descrito un algoritmo9 que permite la segmentación y el seguimiento automatizados de las mitocondrias en archivos time-lapse 2D y 3D de células vivas. Existen otras técnicas de cuantificación y todas tienen sus limitaciones10. Mitometer, una aplicación automatizada de código abierto, es particularmente adecuada para el análisis de lapso de tiempo y dinámica mitocondrial, que requiere poca participación del usuario. Esta aplicación tiene una serie de ventajas frente a otras herramientas existentes basadas en MATLAB, a saber, permite el procesamiento automático de pilas TIF individuales, utilizando hasta 13 parámetros diferentes, especialmente interesante para las neurociencias, ya que diferencia entre mitocondrias perinucleares y telenucleares.
Sin embargo, para un experimento como el descrito anteriormente, estos 13 parámetros aplicados a 225 pilas dan como resultado 2.925 archivos de salida individuales. Estos requieren cuatro entradas individuales de computadora, que suman más de 10,000 entradas manuales que se requieren para descargar todos los archivos de salida. En el caso de los diseños experimentales de gran envergadura, esto da lugar a un análisis de cada archivo e integración de datos que requiere mucho tiempo. En este trabajo presentamos una optimización rutinaria que permite un análisis rápido de archivos, reduciendo en gran medida la lectura de documentos y el procesamiento de datos, analizando los datos de una manera definida, consistente con la salida de las herramientas existentes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Las imágenes de células vivas producen archivos de gran tamaño que requieren un procesamiento informático serio, pero incluso las herramientas más recientes requieren una amplia entrada manual para procesarlas. Esta optimización rutinaria se centra en simplificar el proceso de análisis de mitocondrias en el mitómetro, ya que esta herramienta presenta un muy buen equilibrio entre la entrada del usuario y la salida de datos. Previamente se ha revisado una comparación exhaustiva entre diferentes herramientas para e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La adquisición de imágenes se realizó en la instalación LiM de iBiMED, un nodo de PPBI (Plataforma Portuguesa de BioImagen): POCI-01-0145-FEDER-022122. Este trabajo contó con el apoyo de la FCT (EXPL/BTM-SAL/0902/2021), LCF (CI21-00276), una beca a DT de la Fundação para a Ciência e Tecnologia del Ministério da Educação e Ciência (2020.02006.CEECIND), una beca de ATG-Asociación de Antiguos Alumnos de Gabba a VP y del Instituto de Biomedicina-iBiMED, Universidad de Aveiro.
Materials
| AM580 | Sigma-Aldrich | A8843 | |
| BDNF | Thermo-Fisher | RP8642 | |
| BMS493 | Tocris Bioscience | 3409 | |
| CD2314 | Tocris Bioscience | 3824 | |
| Ch55 | Tocris Bioscience | 2020 | |
| Foetal Bovine Serum | Thermo-Fisher | 10270106 | |
| GraphPad Prism v4.0 | GraphPad Software, La Jolla | n/a | |
| Ham’s F12 Nutrient Mix | Thermo-Fisher | 21765029 | |
| MATLAB R2022a | MathWorks | n/a | |
| Minimal Essential Medium | Thermo-Fisher | 31095 | |
| Nunc Glass Bottom Dishes | Thermo-Fisher | 150680 | |
| Phosphate Buffer Saline Solution | Thermo-Fisher | 28372 | |
| Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| TMRM | Thermo-Fisher | T668 | |
| Zeiss LSM 510 | Carl Zeiss | n/a | Equiped with live-cell imaging culture chamber and 63x oil immersion objective |
References
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