Оптимизированный автоматизированный анализ модуляции гомеостаза митохондрий живых нейронов изоформ-специфическими рецепторами ретиноевой кислоты

Клеточные митохондрии находятся в центре всех физиологических состояний, и глубокое понимание их гомеостаза (митостаза) и поведения имеет первостепенное значение для помощи в определении фармакологического лечения широкого спектра заболеваний, включая рак^{и болезнь Альцгеймера.}

Митохондрии играют важнейшую клеточную роль в энергетическом гомеостазе, выработке АТФ, буферизации кальция и регуляции АФК, а митостаз необходим для поддержания белкового гомеостаза, поскольку молекулярные шапероны^{энергетически} зависимы. Они требуют постоянной и динамической модуляции и адаптации сети для эффективного удовлетворения клеточных потребностей, а транспорт митохондрий регулируется различными сигнальными путями; В предыдущей работе был описан один из таких путей — рецепторы ретиноевой кислоты (RARs)^4,5. Ретиноевая кислота (РА) способствует росту аксонов и нейритов путем активации RAR. В первичных корковых нейронах мыши активация RAR-β стимулирует рост, скорость и подвижность митохондрий в нейрите⁶.

Учитывая адаптивность и динамику митохондриальной сети, возможность оценки митостаза в «реальном времени» имеет важное значение не только для исследования энергетического гомеостаза, но и для протеостаза, клеточного здоровья, пролиферации или передачи сигналов. Широко используемый метод оценки митостаза основан на конфокальной микроскопии после выделения митохондрий с помощью флуоресцентного красителя или маркера, а также на специальной микроскопической установке, позволяющей регулировать температуру и/или_CO2 ⁷. Этот тип экспериментальной установки подразумевает, что за один раз выполняется одна экспериментальная репликация. В дополнение к экспериментальному повторению различных методов лечения, следует учитывать, что большинство экспериментов должны иметь свои технические повторы (когда на пластину изображается более одного положения), с серией фокальных плоскостей (z-стеков), записываемых в ряд временных точек. Таким образом, экспериментальный дизайн с тремя повторениями одного контрольного и двух сеансов обработки, с пятью позициями визуализации на пластину и 15 временными точками, приводит к 225 стопкам для обработки. Как правило, видеозаписи живых митохондрий анализировались путем построения кимографов, которые анализировались индивидуально^{8, в} трудоемком процессе, требующем большого количества ручного ввода, даже при использовании компьютерных инструментов.

Недавно^{был описан} алгоритм, который позволяет автоматически сегментировать и отслеживать митохондрии в 2-D и 3-D таймлапс-файлах живых клеток. Существуют и другие методы количественной оценки, и все они имеют свои ограничения¹⁰. Mitometer, автоматизированное приложение с открытым исходным кодом, особенно подходит для анализа интервальной съемки и динамики митохондрий, требующего минимального участия пользователя. Это приложение имеет ряд преимуществ по сравнению с другими существующими инструментами на основе MATLAB, а именно, позволяет автоматически обрабатывать отдельные стеки TIF, используя до 13 различных параметров, что особенно интересно для нейронаук, поскольку оно различает пери- и телеядерные митохондрии.

Однако для эксперимента, подобного описанному выше, эти 13 параметров, примененных к 225 стекам, приводят к 2925 отдельным выходным файлам. Для этого требуется четыре отдельных компьютерных входа, что в сумме составляет более 10 000 ручных входов, необходимых для загрузки всех выходных файлов. Для крупных экспериментальных проектов это приводит к неоправданно трудоемкому анализу каждого файла и интеграции данных. Здесь мы представляем рутинную оптимизацию, которая позволяет быстро анализировать файлы, значительно сокращая чтение документов и обработку данных, анализируя данные определенным образом, в соответствии с результатами существующих инструментов.