Analyse automatisée optimisée de la modulation de l’homéostasie des mitochondries neuronales vivantes par des récepteurs d’acide rétinoïque spécifiques aux isoformes
Summary
Le réseau mitochondrial est extrêmement complexe, ce qui le rend très difficile à analyser. Un nouvel outil MATLAB analyse les mitochondries confocales en direct dans des images timelapse, mais il en résulte un volume de sortie important nécessitant une attention manuelle individuelle. Pour résoudre ce problème, une optimisation de routine a été développée, permettant une analyse rapide des fichiers.
Abstract
Le réseau mitochondrial complexe rend très difficile la segmentation, le suivi et l’analyse des cellules vivantes. Les outils MATLAB permettent d’analyser les mitochondries dans les fichiers timelapse, ce qui simplifie et accélère considérablement le processus de traitement des images. Néanmoins, les outils existants produisent un grand volume de sortie, nécessitant une attention manuelle individuelle, et les configurations expérimentales de base ont une sortie de milliers de fichiers, chacun nécessitant une manipulation longue et fastidieuse.
Pour résoudre ces problèmes, une optimisation de routine a été développée, à la fois dans le code MATLAB et sous forme de live-script, permettant une analyse rapide des fichiers et réduisant considérablement la lecture des documents et le traitement des données. Avec une vitesse de 100 fichiers/min, l’optimisation permet une analyse globale rapide. L’optimisation permet d’obtenir les résultats obtenus en faisant la moyenne des données spécifiques à l’image pour les mitochondries individuelles sur des périodes de temps, en analysant les données d’une manière définie, cohérente avec les résultats des outils existants. L’imagerie confocale en direct a été réalisée à l’aide de l’ester méthylique de tétraméthylrhodamine, et l’optimisation de routine a été validée en traitant les cellules neuronales avec des agonistes des récepteurs de l’acide rétinoïque (RAR), dont les effets sur les mitochondries neuronales sont établis dans la littérature. Les résultats étaient cohérents avec la littérature et ont permis une caractérisation plus approfondie du comportement du réseau mitochondrial en réponse à la modulation RAR spécifique à l’isoforme.
Cette nouvelle méthodologie a permis une caractérisation rapide et validée du réseau de mitochondries des neurones entiers, mais elle permet également de différencier les mitochondries axonales et cellulaires, une caractéristique essentielle à appliquer dans le domaine des neurosciences. De plus, ce protocole peut être appliqué à des expériences utilisant des traitements à action rapide, permettant l’imagerie des mêmes cellules avant et après les traitements, transcendant le domaine des neurosciences.
Introduction
Les mitochondries cellulaires sont au centre de tous les états physiologiques, et une compréhension approfondie de leur homéostasie (mitostasie) et de leur comportement est primordiale pour aider à identifier le traitement pharmacologique d’un large éventail de maladies, y compris le cancer et la maladie d’Alzheimer 1,2.
Les mitochondries jouent un rôle cellulaire crucial dans l’homéostasie énergétique, la génération d’ATP, le tampon du calcium et la régulation des ROS, et la mitostasie est essentielle au maintien de l’homéostasie des protéines car les chaperons moléculaires dépendent de l’énergie3. Ceux-ci nécessitent une modulation et une adaptation constantes et dynamiques du réseau pour répondre efficacement aux besoins cellulaires, et le transport des mitochondries est régulé par différentes voies de signalisation ; Des travaux antérieurs ont décrit l’une de ces voies, celle des récepteurs de l’acide rétinoïque (RAR)4,5. L’acide rétinoïque (AR) favorise la croissance axonale et neurite via l’activation RAR. Dans les neurones corticaux primaires de souris, l’activation de RAR-β favorise la croissance, la vitesse et la mobilité mitochondriales dans le neurite6.
Compte tenu de l’adaptabilité et de la dynamique du réseau mitochondrial, la possibilité d’évaluer la mitosstasie en « temps réel » est essentielle non seulement pour étudier l’homéostasie énergétique, mais aussi pour la protéostasie, la santé cellulaire, la prolifération ou la signalisation. Une méthode couramment utilisée pour évaluer la mitostase repose sur la microscopie confocale après mise en évidence des mitochondries à l’aide d’un colorant ou d’un marqueur fluorescent, ainsi que sur un dispositif de microscopie spécifique permettant la régulation de la température et/ou duCO2 7. Ce type de configuration expérimentale implique qu’une répétition expérimentale soit effectuée à la fois. En plus de la répétition expérimentale de différents traitements, il faut considérer que la plupart des expériences devraient avoir leurs réplicats techniques (où plus d’une position est imagée par plaque), avec une série de plans focaux (z-stacks) enregistrés dans une série de points temporels. Ainsi, un plan expérimental avec trois répétitions d’un contrôle et de deux traitements, avec cinq positions d’imagerie par plaque et 15 points temporels, aboutit à 225 piles à traiter. Classiquement, les vidéos de mitochondries vivantes étaient analysées en traçant des kymographes, qui seraient analysés individuellement8, dans un processus long nécessitant une saisie manuelle importante, même en s’appuyant sur des outils informatiques.
Un algorithme a récemment été décrit9 qui permet une segmentation et un suivi automatisés des mitochondries dans des fichiers time-lapse 2D et 3D de cellules vivantes. D’autres techniques de quantification sont disponibles, et toutes ont leurs limites10. Mitometer, une application open source automatisée, est particulièrement adaptée à l’analyse en accéléré et à l’analyse de la dynamique des mitochondries, nécessitant peu d’intervention de l’utilisateur. Cette application présente une série d’avantages par rapport aux autres outils MATLAB existants, à savoir permettre le traitement automatique d’empilements TIF individuels, en utilisant jusqu’à 13 paramètres différents, particulièrement intéressant pour les neurosciences, car elle différencie les mitochondries périnucléaires et télénucléaires.
Cependant, pour une expérience telle que celle décrite ci-dessus, ces 13 paramètres appliqués à 225 piles donnent 2 925 fichiers de sortie individuels. Ceux-ci nécessitent quatre entrées informatiques individuelles, ce qui représente plus de 10 000 entrées manuelles nécessaires pour télécharger tous les fichiers de sortie. Pour les grands plans d’expérience, cela se traduit par une analyse inutilement extrêmement longue de chaque fichier et de l’intégration des données. Nous présentons ici une optimisation de routine qui permet une analyse rapide des fichiers, réduisant considérablement la lecture des documents et le traitement des données, analysant les données de manière définie, cohérente avec les résultats des outils existants.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’imagerie de cellules vivantes produit des fichiers volumineux qui nécessitent un traitement informatique sérieux, mais même les outils les plus récents nécessitent une saisie manuelle importante pour être traités. Cette optimisation de routine est axée sur la simplification du processus d’analyse des mitochondries sur le Mitomètre car cet outil présente un très bon équilibre entre l’entrée utilisateur et la sortie des données. Une comparaison complète entre différents outils d’analyse d’images…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
L’acquisition d’images a été réalisée dans l’installation LiM d’iBiMED, un nœud de PPBI (Plateforme portugaise de bioimagerie) : POCI-01-0145-FEDER-022122. Ce travail a été soutenu par FCT (EXPL/BTM-SAL/0902/2021), LCF (CI21-00276), une subvention à DT de la Fundação para a Ciência e Tecnologia du Ministério da Educação e Ciência (2020.02006.CEECIND), une subvention d’ATG-The Gabba Alumni Association au VP, et l’Institut de biomédecine-iBiMED, Université d’Aveiro.
Materials
| AM580 | Sigma-Aldrich | A8843 | |
| BDNF | Thermo-Fisher | RP8642 | |
| BMS493 | Tocris Bioscience | 3409 | |
| CD2314 | Tocris Bioscience | 3824 | |
| Ch55 | Tocris Bioscience | 2020 | |
| Foetal Bovine Serum | Thermo-Fisher | 10270106 | |
| GraphPad Prism v4.0 | GraphPad Software, La Jolla | n/a | |
| Ham’s F12 Nutrient Mix | Thermo-Fisher | 21765029 | |
| MATLAB R2022a | MathWorks | n/a | |
| Minimal Essential Medium | Thermo-Fisher | 31095 | |
| Nunc Glass Bottom Dishes | Thermo-Fisher | 150680 | |
| Phosphate Buffer Saline Solution | Thermo-Fisher | 28372 | |
| Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| TMRM | Thermo-Fisher | T668 | |
| Zeiss LSM 510 | Carl Zeiss | n/a | Equiped with live-cell imaging culture chamber and 63x oil immersion objective |
References
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