アイソフォーム特異的レチノイン酸受容体による生きた神経細胞ミトコンドリアの恒常性調節の最適化された自動解析(英語)

細胞ミトコンドリアはあらゆる生理状態の中心に位置しており、がんやアルツハイマー病など幅広い疾患の薬理学的治療法を特定するためには、ミトコンドリアの恒常性(ミトスタシス)と挙動を完全に理解することが最も重要です^1,2。

ミトコンドリアは、エネルギー恒常性、ATP生成、カルシウム緩衝、ROS調節において重要な細胞の役割を担っており、分子シャペロンはエネルギー依存性であるため、タンパク質の恒常性を維持するためには有糸分裂が不可欠です³。これらには、細胞のニーズを効率的に満たすために、一定かつ動的なネットワークの変調と適応が必要であり、ミトコンドリアの輸送はさまざまなシグナル伝達経路によって制御されています。以前の研究では、そのような経路の1つであるレチノイン酸受容体(^RAR)4,5が説明されています。レチノイン酸(RA)は、RAR活性化を介して軸索および神経突起の成長を促進します。マウスの初代皮質ニューロンでは、RAR-βの活性化により、^神経突起におけるミトコンドリアの成長、速度、および可動性が促進される6。

ミトコンドリアネットワークの適応性と動態を考慮すると、エネルギー恒常性を調べるだけでなく、プロテオスタシス、細胞の健康、増殖、シグナル伝達を調べるためにも、有糸分裂を「リアルタイム」で評価する可能性が不可欠です。有糸分裂を評価するために一般的に使用される方法は、蛍光色素またはマーカーを使用してミトコンドリアを強調した後の共焦点顕微鏡検査、および温度および/または_CO2^{調節を可能にする}特定の顕微鏡検査セットアップに依存しています7。このタイプの実験セットアップでは、一度に1つの実験の複製を実行する必要があります。さまざまな処理の実験の繰り返しに加えて、ほとんどの実験では、一連の焦点面(zスタック)を一連の時点で記録して、技術的な複製(プレートごとに複数の位置を画像化)を行う必要があることを考慮する必要があります。したがって、1 つのコントロールと 2 つの処理を 3 回繰り返し、プレートごとに 5 つのイメージング位置、15 のタイムポイントを使用する実験計画では、225 スタックが処理されます。古典的には、生きたミトコンドリアのビデオは、キモグラフをプロットして分析され、^{個別に分析される}8が、コンピュータツールに頼る場合でも、大量の手入力を必要とする時間のかかるプロセスであった。

最近、生細胞の2Dおよび3Dタイムラプスファイルにおけるミトコンドリアの自動セグメンテーションと追跡を可能にするアルゴリズム^が 記述されました9。他の定量化手法も利用可能であり、すべてに限界があります¹⁰。自動化されたオープンソースアプリケーションであるMitometerは、タイムラプスやミトコンドリアダイナミクス分析に特に適しています。このアプリケーションには、他の既存のMATLABベースのツールに比べて、最大13の異なるパラメータを使用して個々のTIFスタックを自動処理できるという一連の利点があり、核周辺ミトコンドリアと遠隔核ミトコンドリアを区別するため、神経科学にとって特に興味深いものです。

ただし、上記のような実験では、これら 13 個のパラメーターを 225 個のスタックに適用すると、2,925 個の個別の出力ファイルが作成されます。これらには4つの個別のコンピューター入力が必要であり、すべての出力ファイルをダウンロードするには合計で10,000を超える手動入力が必要です。大規模な実験計画では、各ファイルの解析とデータ統合に不必要に非常に時間がかかります。ここでは、迅速なファイル分析を可能にし、ドキュメントの読み取りとデータ処理を大幅に削減し、既存のツールからの出力と一貫性のある定義された方法でデータを分析できるルーチン最適化を紹介します。