Analisi automatizzata ottimizzata della modulazione dell'omeostasi dei mitocondri neuronali vivi da parte dei recettori dell'acido retinoico isoform-specifici

I mitocondri cellulari sono al centro di tutti gli stati fisiologici e una comprensione approfondita della loro omeostasi (mitostasi) e del loro comportamento è fondamentale per aiutare a identificare il trattamento farmacologico per una vasta gamma di malattie, tra cui il cancro e il morbo di Alzheimer ^1,2.

I mitocondri svolgono ruoli cellulari cruciali nell’omeostasi energetica, nella generazione di ATP, nel tamponamento del calcio e nella regolazione dei ROS, e la mitostasi è essenziale per mantenere l’omeostasi proteica poiché gli chaperoni molecolari sono dipendenti dall’energia³. Questi richiedono una modulazione e un adattamento di rete costanti e dinamici per soddisfare in modo efficiente le esigenze cellulari e il trasporto dei mitocondri è regolato da diverse vie di segnalazione; Lavori precedenti hanno descritto uno di questi percorsi, quello dei recettori dell’acido retinoico (RARs)^4,5. L’acido retinoico (RA) promuove la crescita assonale e neuritica attraverso l’attivazione di RAR. Nei neuroni corticali primari del topo, l’attivazione di RAR-β incoraggia la crescita mitocondriale, la velocità e la mobilità nel neurite⁶.

Considerando l’adattabilità e la dinamica della rete mitocondriale, la possibilità di valutare la mitostasi in “tempo reale” è essenziale non solo per studiare l’omeostasi energetica, ma anche per la proteostasi, la salute cellulare, la proliferazione o la segnalazione. Un metodo comunemente usato per valutare la mitostasi si basa sulla microscopia confocale dopo aver evidenziato i mitocondri utilizzando un colorante o un marcatore fluorescente, nonché una configurazione di microscopia specifica che consente la regolazione della temperatura e/o della CO₂ ⁷. Questo tipo di configurazione sperimentale prevede l’esecuzione di una replica sperimentale alla volta. Oltre alla ripetizione sperimentale di diversi trattamenti, va considerato che la maggior parte degli esperimenti dovrebbe avere le proprie repliche tecniche (in cui viene ripresa più di una posizione per lastra), con una serie di piani focali (z-stack) registrati in una serie di punti temporali. Pertanto, un disegno sperimentale con tre ripetizioni di un controllo e due trattamenti, con cinque posizioni di imaging per piastra e 15 punti temporali, si traduce in 225 pile da elaborare. Classicamente, i video dei mitocondri vivi sono stati analizzati tracciando i kymografi, che sarebbero stati analizzati individualmente⁸, in un processo che richiedeva molto tempo e che richiedeva un ampio input manuale, anche quando ci si affidava a strumenti informatici.

Recentemente è stato descritto un algoritmo⁹ che consente la segmentazione e il tracciamento automatizzati dei mitocondri in file time-lapse 2D e 3D di cellule vive. Sono disponibili altre tecniche di quantificazione, e tutte hanno i loro limiti¹⁰. Mitometer, un’applicazione open source automatizzata, è particolarmente adatta per l’analisi del time lapse e della dinamica dei mitocondri, richiedendo un basso input da parte dell’utente. Questa applicazione presenta una serie di vantaggi rispetto ad altri strumenti esistenti basati su MATLAB, ovvero la possibilità di elaborare automaticamente i singoli stack TIF, utilizzando fino a 13 parametri diversi, particolarmente interessante per le neuroscienze, in quanto differenzia tra mitocondri peri- e tele-nucleari.

Tuttavia, per un esperimento come quello sopra descritto, questi 13 parametri applicati a 225 stack danno come risultato 2.925 singoli file di output. Questi richiedono quattro input individuali del computer, che sommano oltre 10.000 input manuali necessari per scaricare tutti i file di output. Per i progetti sperimentali di grandi dimensioni, ciò si traduce in un’analisi inutilmente estremamente dispendiosa in termini di tempo di ogni file e integrazione dei dati. Qui presentiamo un’ottimizzazione di routine che consente una rapida analisi dei file, riducendo notevolmente la lettura dei documenti e l’elaborazione dei dati, analizzando i dati in modo definito, coerente con l’output degli strumenti esistenti.