Summary

Усовершенствованный метод изоляции митохондриальных контактных участков

Published: June 16, 2023
doi:

Summary

Митохондриальные контактные сайты представляют собой белковые комплексы, которые взаимодействуют с митохондриальными внутренними и внешними мембранными белками. Эти участки необходимы для связи между митохондриальными мембранами и, таким образом, между цитозолем и митохондриальным матриксом. В этой статье мы опишем метод выявления кандидатов, подходящих для этого конкретного класса белков.

Abstract

Митохондрии присутствуют практически во всех эукариотических клетках и выполняют важнейшие функции, выходящие далеко за рамки производства энергии, например, синтез железо-серных кластеров, липидов или белков, буферизациюCa2+ и индукцию апоптоза. Кроме того, митохондриальная дисфункция приводит к тяжелым заболеваниям человека, таким как рак, диабет и нейродегенерация. Для того, чтобы выполнять эти функции, митохондрии должны взаимодействовать с остальной частью клетки через свою оболочку, состоящую из двух мембран. Поэтому эти две мембраны должны постоянно взаимодействовать. Белковые контактные участки между внутренней и внешней мембранами митохондрий имеют важное значение в этом отношении. На данный момент выявлено несколько мест контакта. В описанном здесь методе митохондрии Saccharomyces cerevisiae используются для выделения контактных сайтов и, таким образом, идентификации кандидатов, которые квалифицируются для белков контактных сайтов. Мы использовали этот метод для идентификации митохондриального контактного сайта и комплекса организующей системы cristae (MICOS), одного из основных контактных сайтов-образующих комплексов во внутренней мембране митохондрий, который сохраняется от дрожжей до человека. Недавно мы усовершенствовали этот метод, чтобы идентифицировать новый контактный сайт, состоящий из Cqd1 и комплекса Por1-Om14.

Introduction

Митохондрии выполняют множество различных функций у эукариот, наиболее известной из которых является производство АТФ путем окислительного фосфорилирования. Другие функции включают производство железо-серных кластеров, синтез липидов, а у высших эукариот — передачу сигналов Ca2+ и индукцию апоптоза 1,2,3,4. Эти функции неразрывно связаны с их сложной ультраструктурой.

Митохондриальная ультраструктура была впервые описана с помощью электронной микроскопии5. Показано, что митохондрии представляют собой достаточно сложные органеллы, состоящие из двух мембран: митохондриальной наружной мембраны и митохондриальной внутренней мембраны. Таким образом, этими мембранами образуются два водных компартмента: межмембранное пространство и матрикс. Митохондриальная внутренняя мембрана может быть еще более разделена на различные секции. Внутренняя пограничная мембрана находится в непосредственной близости от наружной, а кристы образуют инвагинации. Так называемые кристальные соединения соединяют внутреннюю пограничную мембрану и кристы (рис. 1). Кроме того, электронные микрофотографии осмотически сморщенных митохондрий показывают, что существуют участки, в которых митохондриальные мембраны плотно соединены 6,7. Эти так называемые контактные участки образованы белковыми комплексами, охватывающими две мембраны (рис. 1). Считается, что эти сайты взаимодействия необходимы для жизнеспособности клеток из-за их важности для регуляции митохондриальной динамики и наследования, а также передачи метаболитов и сигналов между цитозолью и матриксом8.

Комплекс MICOS во внутренней мембране митохондрий, вероятно, является наиболее охарактеризованным и наиболее универсальным контактным сайтообразующим комплексом. MICOS был описан у дрожжей в 2011 году и состоит из шести субъединиц 9,10,1 1: Mic60, Mic27, Mic26, Mic19, Mic12 и Mic10. Они образуют комплекс примерно в 1,5 МДа, который локализуется в кристальных соединениях 9,10,11. Удаление одной из основных субъединиц, Mic10 или Mic60, приводит к отсутствию этого комплекса 9,11, что означает, что эти две субъединицы необходимы для стабильности MICOS. Интересно, что MICOS образует не один, а несколько сайтов контакта с различными белками и комплексами митохондриальной внешней мембраны: комплексом TOM 11,12, комплексом TOB/SAM 9,12,13,14,15,16, комплексом Fzo1-Ugo19, Por1 10, OM45 10 и Miro 17. Это убедительно указывает на то, что комплекс MICOS участвует в различных митохондриальных процессах, таких как импорт белка, метаболизм фосфолипидов и генерация митохондриальной ультраструктуры18. Последняя функция, вероятно, является основной функцией MICOS, поскольку отсутствие комплекса MICOS, индуцированного делецией MIC10 или MIC60, приводит к аномальной ультраструктуре митохондрий, в которой практически полностью отсутствуют регулярные кристы. Вместо этого внутренние мембранные везикулы без соединения с внутренней пограничной мембраной накапливают19, 20. Важно отметить, что MICOS сохраняется по форме и функциям от дрожжей до человека21. Связь мутаций в субъединицах MICOS с тяжелыми заболеваниями человека также подчеркивает ее важность для высших эукариот22,23. Несмотря на то, что MICOS очень универсален, необходимо наличие дополнительных мест контакта (на основании наших неопубликованных наблюдений). Действительно, было идентифицировано несколько других мест контакта, например, механизмы митохондриального слияния Mgm1-Ugo1/Fzo1 24,25,26 или Mdm31-Por1, который участвует в биосинтезе митохондриально-специфического фосфолипидного кардиолипина 27. Недавно мы усовершенствовали метод, который привел нас к идентификации MICOS для идентификации Cqd1 как части нового контактного сайта, образованного с внешним мембранным комплексом Por1-Om1428. Интересно, что этот контактный сайт также, по-видимому, участвует во многих процессах, таких как гомеостаз митохондриальных мембран, метаболизм фосфолипидов и распределение коэнзима Q28,29.

Здесь мы использовали вариацию ранее описанного фракционирования митохондрий 9,30,31,32,33. Осмотическая обработка митохондрий приводит к разрушению митохондриальной внешней мембраны и к уменьшению матричного пространства, оставляя две мембраны только в непосредственной близости в местах контакта. Это позволяет генерировать везикулы, состоящие исключительно из митохондриальной внешней мембраны или митохондриальной внутренней мембраны или в местах контакта обеих мембран с помощью мягкого ультразвукового воздействия. Из-за того, что внутренняя мембрана митохондрий обладает гораздо более высоким соотношением белка к липидам, пузырьки внутренней мембраны митохондрий демонстрируют более высокую плотность по сравнению с пузырьками внешней мембраны митохондрий. Разница в плотности может быть использована для разделения мембранных везикул с помощью центрифугирования с градиентом плотности сахарозы. Таким образом, пузырьки внешней мембраны митохондрий накапливаются при низких концентрациях сахарозы, в то время как пузырьки внутренней мембраны митохондрий обогащаются при высоких концентрациях сахарозы. Везикулы, содержащие контактные участки, концентрируются в промежуточных концентрациях сахарозы (рис. 2). Следующий протокол подробно описывает этот усовершенствованный метод, который требует меньше специализированного оборудования, времени и энергии по сравнению с нашим ранее разработанным методом32 и предоставляет полезный инструмент для идентификации возможных белков контактного сайта.

Protocol

1. Буферы и складские растворы Раствор 1 М 3-морфолинопропан-1-сульфоновой кислоты (MOPS) в деионизированной воде, рН 7,4. Хранить при температуре 4 °C. Приготовьте 500 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) в деионизированной воде, рН 8,0. Хранить при комнатной температур…

Representative Results

Относительно легко разделить внутреннюю и внешнюю мембраны митохондрий. Однако генерация и разделение пузырьков, содержащих контактный сайт, значительно сложнее. На наш взгляд, важными и важными являются два этапа: условия ультразвуковой обработки и используемый градиент. <p class="jove_c…

Discussion

Митохондриальное субфракционирование представляет собой сложный эксперимент с несколькими очень сложными этапами. Поэтому мы стремились к дальнейшему совершенствованию и, в определенной степени, к упрощению нашего устоявшегося метода32. Здесь сложность заключалась в то…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

M.E.H. выражает благодарность Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), проект номер 413985647, за финансовую поддержку. Авторы благодарят д-ра Михаэля Киблера, Университет Людвига-Максимилиана, Мюнхен, за его щедрую и всестороннюю поддержку. Мы благодарны Вальтеру Нойперту за его научный вклад, полезные дискуссии и постоянное вдохновение. Й.Ф. благодарит Высшую школу наук о жизни в Мюнхене (LSM) за поддержку.

Materials

13.2 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 14 x 89mm Beckman Instruments, Germany 344059
50 mL, Open-Top Thickwall Polycarbonate Open-Top Tube, 29 x 104mm Beckman Instruments, Germany 363647
A-25.50 Fixed-Angle Rotor- Aluminum, 8 x 50 mL, 25,000 rpm, 75,600 x g Beckman Instruments, Germany 363055
Abbe refractometer Zeiss, Germany discontinued,
any pipet controller will suffice
accu-jet pro Pipet Controller Brandtech, USA BR26320 discontinued,
any pipet controller will suffice
Beaker 1000 mL DWK Life Science, Germany C118.1
Branson  Digital Sonifier W-250 D Branson Ultrasonics, USA FIS15-338-125
Branson Ultrasonic 3mm TAPERED MICROTIP Branson Ultrasonics, USA 101-148-062
Branson Ultrasonics 200- and 400-Watt Sonifiers: Rosette Cooling Cell Branson Ultrasonics, USA 15-338-70
Centrifuge Avanti JXN-26 Beckman Instruments, Germany B37912
Centrifuge Optima XPN-100 ultra Beckman Instruments, Germany 8043-30-0031
cOmplete Proteaseinhibtor-Cocktail Roche, Switzerland 11697498001
D-Sorbit Roth, Germany 6213
EDTA (Ethylendiamin-tetraacetic acid disodium salt dihydrate) Roth, Germany 8043
Erlenmeyer flask, 100 mL Roth, Germany X747.1
graduated pipette, Kl. B, 25:0, 0.1 Hirschmann, Germany 1180170
graduated pipette, Kl. B, 5:0, 0.05 Hirschmann, Germany 1180153
ice bath neoLab, Germany  S12651
Magnetic stirrer RCT basic IKA-Werke GmbH, Germany Z645060GB-1EA
MOPS (3-(N-Morpholino)propanesulphonic acid) Gerbu, Germany 1081
MyPipetman Select P1000 Gilson, USA FP10006S
MyPipetman Select P20 Gilson, USA FP10003S
MyPipetman Select P200 Gilson, USA FP10005S
Omnifix 1 mL Braun, Germany 4022495251879
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Serva, Germany 32395.03
STERICAN cannula 21 Gx4 4/5 0.8×120 mm Braun, Germany 4022495052414
stirring bar, 15 mm VWR, USA 442-0366
Sucrose Merck, Germany S8501
SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor Beckman Instruments, Germany 331362
Test tubes Eppendorf, Germany 3810X
Tissue grinders, Potter-Elvehjem type, 2 mL glass vessel VWR, USA 432-0200
Tissue grinders, Potter-Elvehjem type, 2 mL plunger with serrated tip VWR, USA 432-0212
Trichloroacetic acid (TCA) Sigma Aldrich, Germany 33731 discontinued,
any TCA will suffice (CAS: 73-03-9)
TRIS Roth, Germany 4855

References

  1. Braymer, J. J., Freibert, S. A., Rakwalska-bange, M., Lill, R. BBA – Molecular Cell Research Mechanistic concepts of iron-sulfur protein biogenesis in Biology * General concepts of FeS protein biogenesis. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Molecular Cell Research. 1868 (1), 118863 (2021).
  2. Osman, C., Merkwirth, C., Langer, T. Prohibitins and the functional compartmentalization of mitochondrial membranes. Journal of Cell Science. 122 (21), 3823-3830 (2009).
  3. Smaili, S. S., Hsu, Y., Youle, R. J., Russell, J. T. Mitochondria in Ca 2 %. Signaling and Apoptosis. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 32 (1), (2000).
  4. Rolland, S. G., Conradt, B. New role of the BCL2 family of proteins in the regulation of mitochondrial dynamics. Current Opinion in Cell Biology. 22 (6), 852-858 (2011).
  5. Palade, G. E. An electron microscope study of the mitochondrial structure. The journal of histochemistry and cytochemistry: official journal of the Histochemistry Society. 1 (4), 188-211 (1953).
  6. Hackenbrock, C. R. Ultrastructural bases for metabolically linked mechanical activity in mitochondria. I. Reversible ultrastructural changes with change in metabolic steady state in isolated liver mitochondria. The Journal of cell biology. 30 (2), 269-297 (1966).
  7. Hackenbrock, C. R. Chemical and physical fixation of isolated mitochondria in low-energy and high-energy states. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 61 (2), 598-605 (1968).
  8. Reichert, A. S., Neupert, W. Contact sites between the outer and inner membrane of mitochondria – Role in protein transport. Biochimica et Biophysica Acta – Molecular Cell Research. 1592 (1), 41-49 (2002).
  9. Harner, M., et al. The mitochondrial contact site complex, a determinant of mitochondrial architecture. EMBO Journal. 30 (21), 4356-4370 (2011).
  10. Hoppins, S., et al. A mitochondrial-focused genetic interaction map reveals a scaffold-like complex required for inner membrane organization in mitochondria. Journal of Cell Biology. 195 (2), 323-340 (2011).
  11. vonder Malsburg, K., et al. Dual Role of Mitofilin in Mitochondrial Membrane Organization and Protein Biogenesis. Developmental Cell. 21 (4), 694-707 (2011).
  12. Bohnert, M., et al. Role of mitochondrial inner membrane organizing system in protein biogenesis of the mitochondrial outer membrane. Molecular Biology of the Cell. 23 (20), 3948-3956 (2012).
  13. Darshi, M., et al. ChChd3, an inner mitochondrial membrane protein, is essential for maintaining Crista integrity and mitochondrial function. Journal of Biological Chemistry. 286 (4), 2918-2932 (2011).
  14. Körner, C., et al. The C-terminal domain of Fcj1 is required for formation of crista junctions and interacts with the TOB/SAM complex in mitochondria. Molecular Biology of the Cell. 23 (11), 2143-2155 (2012).
  15. Xie, J., Marusich, M. F., Souda, P., Whitelegge, J., Capaldi, R. A. The mitochondrial inner membrane protein Mitofilin exists as a complex with SAM50, metaxins 1 and 2, coiled-coil-helix coiled-coil-helix domain-containing protein 3 and 6 and DnaJC11. FEBS Letters. 581 (18), 3545-3549 (2007).
  16. Zerbes, R. M., et al. Role of MINOS in mitochondrial membrane architecture: Cristae morphology and outer membrane interactions differentially depend on mitofilin domains. Journal of Molecular Biology. 422 (2), 183-191 (2012).
  17. Modi, S., et al. Miro clusters regulate ER-mitochondria contact sites and link cristae organization to the mitochondrial transport machinery. Nature Communications. 10 (1), 4399 (2019).
  18. Khosravi, S., Harner, M. E. The MICOS complex, a structural element of mitochondria with versatile functions. Biological Chemistry. 401 (6-7), 765-778 (2020).
  19. John, G. B., et al. The mitochondrial inner membrane protein mitofilin controls cristae morphology. Molecular Biology of the Cell. 16 (3), 1543-1554 (2005).
  20. Rabl, R., et al. Formation of cristae and crista junctions in mitochondria depends on antagonism between Fcj1 and Su e/g. Journal of Cell Biology. 185 (6), 1047-1063 (2009).
  21. Alkhaja, A. K., et al. MINOS1 is a conserved component of mitofilin complexes and required for mitochondrial function and cristae organization. Molecular Biology of the Cell. 23 (2), 247-257 (2012).
  22. Eramo, M. J., Lisnyak, V., Formosa, L. E., Ryan, M. T. The "mitochondrial contact site and cristae organising system" (MICOS) in health and human disease. Journal of Biochemistry. 167 (3), 243-255 (2020).
  23. Ikeda, A., Imai, Y., Hattori, N. Neurodegeneration-associated mitochondrial proteins, CHCHD2 and CHCHD10-what distinguishes the two. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 1-12 (2022).
  24. Sesaki, H., Southard, S. M., Yaffe, M. P., Jensen, R. E. Mgm1p, a dynamin-related GTPase, is essential for fusion of the mitochondrial outer membrane. Molecular Biology of the Cell. 14 (6), 2342-2356 (2003).
  25. Fritz, S., Rapaport, D., Klanner, E., Neupert, W., Westermann, B. Connection of the mitochondrial outer and inner membranes by Fzo1 is critical for organellar fusion. Journal of Cell Biology. 152 (4), 683-692 (2001).
  26. Wong, E. D., et al. The intramitochondrial dynamin-related GTPase, Mgm1p, is a component of a protein complex that mediates mitochondrial fusion. Journal of Cell Biology. 160 (3), 303-311 (2003).
  27. Miyata, N., Fujii, S., Kuge, O. Porin proteins have critical functions in mitochondrial phospholipid metabolism in yeast. Journal of Biological Chemistry. 293 (45), 17593-17605 (2018).
  28. Khosravi, S., et al. The UbiB family member Cqd1 forms a novel membrane contact site in mitochondria. J Cell Sci. , (2023).
  29. Kemmerer, Z. A., et al. UbiB proteins regulate cellular CoQ distribution in Saccharomyces cerevisiae. Nature Communications. 12 (1), 4769 (2021).
  30. Pon, L., Moll, T., Vestweber, D., Marshallsay, B., Schatz, G. Protein import into mitochondria: ATP-dependent protein translocation activity in a submitochondrial fraction enriched in membrane contact sites and specific proteins. Journal of Cell Biology. 109, 2603-2616 (1989).
  31. Lithgow, T., Timms, M., Hj, P. B., Hoogenraad, N. J. Identification of a GTP-binding protein in the contact sites between inner and outer mitochondrial membranes. Biochemical and Biophysical Research Communications. 180 (3), 1453-1459 (1991).
  32. Harner, M. Isolation of contact sites between inner and outer mitochondrial membranes. Methods in Molecular Biology. 1567, 43-51 (2017).
  33. Adams, V., Bosch, W., Schlegel, J., Wallimann, T., Brdiczka, D. Further characterization of contact sites from mitochondria of different tissues: topology of peripheral kinases. BBA – Biomembranes. 981 (2), 213-225 (1989).
  34. Izawa, T., Unger, A. K. Isolation of mitochondria from Saccharomyces cerevisiae. Methods in Molecular Biology. 1567, 33-42 (2017).
  35. Gregg, C., Kyryakov, P., Titorenko, V. I. Purification of mitochondria from yeast cells. Journal of Visualized Experiments. (30), 17-19 (2009).
  36. Beavis, A. D., Brannan, R. D., Garlid, K. D. Swelling and Contraction of the Mitochondrial Matrix I. A structural interpretation of the relationship between light scattering and matrix volume. Journal of Biological Chemistry. 260 (25), 13424-13433 (1985).
  37. Born, M., Wolf, E. . Principles of optics electromagnetic theory of propagation, interference and diffraction of light. , (1999).
  38. Koontz, L. TCA precipitation. Methods in Enzymology. 541, 3-10 (2014).
  39. Laemmli, U. K. Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
  40. Renart, J., Reiser, J., Stark, G. R. Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: A method for studying antibody specificity and antigen structure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (7), 3116-3120 (1979).
  41. Al-Tubuly, A. A. SDS-PAGE and Western Blotting. Methods Mol Med. 40, 391-405 (2000).
  42. Kurien, B. T., Hal Scofield, R. Western blotting: Methods and protocols. Western Blotting: Methods and Protocols. (3), 1 (2015).
  43. Gallagher, S., Chakavarti, D. Immunoblot analysis. Journal of Visualized Experiments. (16), (2008).
  44. Sherman, F. Getting Started with Yeast. Methods in Enzymology. 194, 3-21 (1991).
  45. Howson, R., et al. Construction, verification and experimental use of two epitope-tagged collections of budding yeast strains. Comparative and Functional Genomics. 6 (1-2), 2-16 (2005).
  46. Knop, M., et al. Epitope tagging of yeast genes using a PCR-based strategy: More tags and improved practical routines. Yeast. 15, 963-972 (1999).
  47. Longtine, M. S., et al. Additional modules for versatile and economical PCR-based gene deletion and modification in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 14 (10), 953-961 (1998).
  48. Tsai, P. I., et al. PINK1 Phosphorylates MIC60/Mitofilin to Control Structural Plasticity of Mitochondrial Crista Junctions. Molecular Cell. 69 (5), 744-756 (2018).
  49. Xiao, T., et al. Identification of CHCHD10 Mutation in Chinese Patients with Alzheimer Disease. Molecular Neurobiology. 54 (7), 5243-5247 (2017).
  50. Bannwarth, S., et al. A mitochondrial origin for frontotemporal dementia and amyotrophic lateral sclerosis through CHCHD10 involvement. Brain. 137 (8), 2329-2345 (2014).
  51. Chaussenot, A., et al. Screening of CHCHD10 in a French cohort confirms the involvement of this gene in frontotemporal dementia with amyotrophic lateral sclerosis patients. Neurobiology of Aging. 35 (12), 1-4 (2014).
  52. Chiò, A., et al. CHCH10 mutations in an Italian cohort of familial and sporadic amyotrophic lateral sclerosis patients. Neurobiology of Aging. 36 (4), 3-6 (2015).
  53. Genin, E. C., et al. CHCHD 10 mutations promote loss of mitochondrial cristae junctions with impaired mitochondrial genome maintenance and inhibition of apoptosis. EMBO Molecular Medicine. 8 (1), 58-72 (2016).
  54. Bannwarth, S., et al. A mitochondrial origin for frontotemporal dementia and amyotrophic lateral sclerosis through CHCHD10 involvement. Brain. 137 (8), 2329-2345 (2014).

Play Video

Cite This Article
Khosravi, S., Frickel, J., Harner, M. E. An Improved Method to Isolate Mitochondrial Contact Sites. J. Vis. Exp. (196), e65444, doi:10.3791/65444 (2023).

View Video