ミトコンドリア接触部位を単離するための改良された方法

ミトコンドリアは真核生物においてさまざまな機能を果たしており、最もよく知られているのは酸化的リン酸化によるATPの産生です。その他の機能には、鉄-硫黄クラスターの生成、脂質合成、および高等真核生物では^Ca2+シグナル伝達、およびアポ^{トーシスの}誘導が含まれます1,2,3,4。これらの機能は、その複雑な超微細構造と不可分に結びついています。

ミトコンドリアの超微細構造は、電子^{顕微鏡5によって}最初に記述された。ミトコンドリアは、ミトコンドリア外膜とミトコンドリア内膜の2つの膜からなるかなり複雑な細胞小器官であることが示されました。したがって、2つの水性区画がこれらの膜によって形成される:膜間空間およびマトリックス。ミトコンドリアの内膜は、さらに異なるセクションに分けることができます。内側の境界膜は外側の膜に近接しており、クリステは陥入を形成します。いわゆるクリスタ接合部は、内側の境界膜とクリステをつなぎます(図1)。さらに、浸透圧的に縮小したミトコンドリアの電子顕微鏡写真は、ミトコンドリア膜が緊密に結合している部位が存在することを明らかにした^6,7。これらのいわゆるコンタクトサイトは、2つの膜にまたがるタンパク質複合体によって形成されます(図1)。これらの相互作用部位は、ミトコンドリアの動態と遺伝の調節、ならびに細胞質とマトリックスの間の代謝産物とシグナルの伝達にとって重要であるため、細胞の生存に不可欠である^{と考えられている8。}

ミトコンドリア内膜のMICOS複合体は、おそらく最もよく特徴付けられ、最も用途の広いコンタクトサイト形成複合体です。MICOSは2011年に酵母で記載され、Mic60、Mic27、Mic26、Mic19、Mic12、Mic10の6つの^{サブユニット9,10,1}で構成されています。これらは約1.5MDaの複合体を形成し、クリスタ接合^部9,10,11に局在する。Mic10またはMic60のいずれかのコアサブユニットが欠失すると、この複合体が欠損する^9,11ため、これら2つのサブユニット^がMICOSの安定性に不可欠である。興味深いことに、MICOSは、TOM複合体11,12、TOB/SAM複合体^{9,12,13,14,15,16}、Fzo1-Ugo1^複合体9、Por1 10、OM45 10、Miro ¹⁷など、様々なミトコンドリア外膜タンパク質および複合体と1つだけでなく複数の接触部位を形成します.このことは、MICOS複合体が、タンパク質の取り込み、リン脂質代謝、ミトコンドリアの超微細構造の生成など、様々なミトコンドリアプロセスに関与していることを強く示唆している¹⁸。後者の機能は、MIC10またはMIC60の欠失によって誘導されるMICOS複合体の欠如が、事実上完全に規則的なクリステを欠く異常なミトコンドリアの超微細構造をもたらすため、おそらくMICOSの主要な機能である。その代わりに、内界膜と接続していない内膜小胞が蓄積する^19、20。重要なことに、MICOSは酵母からヒトまで形態と機能が保存されています²¹。MICOSサブユニットの変異と重篤なヒト疾患との関連は、高等真核生物にとっての重要性も強調している^22,23。MICOSは非常に用途が広いですが、追加の接触サイトが存在する必要があります(未発表の観察に基づく)。実際、ミトコンドリア特異的リン脂質カルジオリピンの生合成に関与するミトコンドリア融合機構Mgm1-Ugo1/Fzo1^24,25,26またはMdm31-Por1など、他のいくつかの接触部位が同定されている²⁷。最近、我々はMICOSの同定に至った手法を改良し、外膜複合体Por1-Om14と形成される新規接触部位の一部としてCqd1を同定した²⁸。興味深いことに、この接触部位は、ミトコンドリア膜の恒常性、リン脂質代謝、コエンザイム^Q28,29の分布などの複数のプロセスにも関与しているようです。

ここでは、先に述べたミトコン^ドリア9,30,31,32,33の分画の変形を用いた。ミトコンドリアの浸透圧処理は、ミトコンドリア外膜の破壊とマトリックス空間の収縮をもたらし、2つの膜は接触部位でのみ近接した状態になります。これにより、ミトコンドリア外膜またはミトコンドリア内膜のみからなる、または軽度の超音波処理による両方の膜の接触部位を含む小胞の生成が可能になります。ミトコンドリア内膜はタンパク質と脂質の比率がはるかに高いため、ミトコンドリア内膜小胞はミトコンドリア外膜小胞と比較してより高い密度を示します。密度の差を利用して、スクロース浮力密度勾配遠心分離により膜小胞を分離することができます。したがって、ミトコンドリア外膜小胞は低スクロース濃度で蓄積し、ミトコンドリア内膜小胞は高スクロース濃度で濃縮されます。接触部位を含む小胞は、中程度のスクロース濃度で濃縮されます(図2)。以下のプロトコルは、以前に確立されたもの³²と比較して、より少ない専門機器、時間、およびエネルギーを必要とするこの改良された方法を詳細に説明し、可能な接触部位タンパク質の同定のための有用なツールを提供します。