طريقة محسنة لعزل مواقع ملامسة الميتوكوندريا
Summary
مواقع ملامسة الميتوكوندريا هي مجمعات بروتينية تتفاعل مع بروتينات الغشاء الداخلي والخارجي للميتوكوندريا. هذه المواقع ضرورية للتواصل بين أغشية الميتوكوندريا ، وبالتالي بين السيتوسول ومصفوفة الميتوكوندريا. نصف هنا طريقة لتحديد المرشحين المؤهلين لهذه الفئة المحددة من البروتينات.
Abstract
توجد الميتوكوندريا في جميع الخلايا حقيقية النواة تقريبا وتؤدي وظائف أساسية تتجاوز إنتاج الطاقة ، على سبيل المثال ، تخليق مجموعات الحديد والكبريت أو الدهون أو البروتينات ، والتخزين المؤقت Ca2+ ، وتحريض موت الخلايا المبرمج. وبالمثل ، يؤدي خلل الميتوكوندريا إلى أمراض بشرية حادة مثل السرطان والسكري والتنكس العصبي. من أجل أداء هذه الوظائف ، يجب على الميتوكوندريا التواصل مع بقية الخلية عبر غلافها ، والذي يتكون من غشاءين. لذلك ، يجب أن يتفاعل هذان الغشاءان باستمرار. مواقع الاتصال البروتينية بين الأغشية الداخلية والخارجية للميتوكوندريا ضرورية في هذا الصدد. حتى الآن ، تم تحديد العديد من مواقع الاتصال. في الطريقة الموضحة هنا ، تستخدم Saccharomyces cerevisiae mitochondria لعزل مواقع الاتصال ، وبالتالي تحديد المرشحين المؤهلين للحصول على بروتينات موقع الاتصال. استخدمنا هذه الطريقة لتحديد موقع ملامسة الميتوكوندريا ومجمع نظام تنظيم cristae (MICOS) ، وهو أحد مجمعات تكوين موقع التلامس الرئيسية في الغشاء الداخلي للميتوكوندريا ، والذي يتم حفظه من الخميرة إلى البشر. في الآونة الأخيرة ، قمنا بتحسين هذه الطريقة لتحديد موقع اتصال جديد يتكون من Cqd1 ومجمع Por1-Om14.
Introduction
تؤدي الميتوكوندريا مجموعة متنوعة من الوظائف المختلفة في حقيقيات النوى، وأكثرها شهرة إنتاج الأدينوسين الثلاثي الفوسفات (ATP) من خلال الفسفرة التأكسدية. تشمل الوظائف الأخرى إنتاج مجموعات الحديد والكبريت ، وتخليق الدهون ، وفي حقيقيات النوى العليا ، وإشارات Ca2+ ، وتحريض موت الخلايا المبرمج1،2،3،4. ترتبط هذه الوظائف ارتباطا لا ينفصم ببنيتها الفائقة المعقدة.
تم وصف البنية الفوقية للميتوكوندريا لأول مرة بواسطة المجهر الإلكتروني5. وقد تبين أن الميتوكوندريا هي عضيات معقدة إلى حد ما تتكون من غشاءين: الغشاء الخارجي للميتوكوندريا والغشاء الداخلي للميتوكوندريا. وبالتالي ، يتم تشكيل مقصورتين مائيتين بواسطة هذه الأغشية: الفضاء بين الغشاء والمصفوفة. يمكن تقسيم الغشاء الداخلي للميتوكوندريا إلى أقسام مختلفة. يبقى الغشاء الحدودي الداخلي على مقربة من الغشاء الخارجي ، ويشكل cristae غزوات. ما يسمى تقاطعات crista تربط الغشاء الحدودي الداخلي و cristae (الشكل 1). علاوة على ذلك ، تكشف الصور المجهرية الإلكترونية للميتوكوندريا المنكمشة تناضحيا عن وجود مواقع ترتبط فيها أغشية الميتوكوندريا بإحكام 6,7. تتشكل مواقع الاتصال المزعومة هذه بواسطة مجمعات بروتينية تمتد على الغشاءين (الشكل 1). يعتقد أن مواقع التفاعل هذه ضرورية لصلاحية الخلية نظرا لأهميتها لتنظيم ديناميكيات الميتوكوندريا والوراثة ، وكذلك نقل المستقلبات والإشارات بين السيتوسول والمصفوفة8.
من المحتمل أن يكون مجمع MICOS في الغشاء الداخلي للميتوكوندريا هو أفضل مركب مميز وأكثر تنوعا لتشكيل موقع الاتصال. تم وصف MICOS في الخميرة في عام 2011 ، ويتكون من ست وحدات فرعية9،10،1 1: Mic60 و Mic27 و Mic26 و Mic19 و Mic12 و Mic10. هذه تشكل مجمعا من حوالي 1.5 MDa الذي يتمركز إلى تقاطعات crista9،10،11. يؤدي حذف أي من الوحدات الفرعية الأساسية ، Mic10 أو Mic60 ، إلى عدم وجود هذا المجمع 9,11 ، مما يعني أن هاتين الوحدتين الفرعيتين ضروريتان لاستقرار MICOS. ومن المثير للاهتمام ، أن MICOS لا يشكل موقعا واحدا فحسب ، بل مواقع اتصال متعددة مع بروتينات ومجمعات غشاء خارجي مختلفة من الميتوكوندريا: مجمع TOM 11,12 ، مركب TOB / SAM 9,12,13,14,15,16 ، مجمع Fzo1-Ugo1 9 ، Por1 10 ، OM45 10 ، و Miro 17. يشير هذا بقوة إلى أن مجمع MICOS يشارك في عمليات الميتوكوندريا المختلفة ، مثل استيراد البروتين ، واستقلاب الفوسفوليبيد ، وتوليد البنية الفوقية للميتوكوندريا18. من المحتمل أن تكون الوظيفة الأخيرة هي الوظيفة الرئيسية ل MICOS ، حيث أن غياب مركب MICOS الناجم عن حذف MIC10 أو MIC60 يؤدي إلى بنية فائقة غير طبيعية للميتوكوندريا تفتقر تماما إلى cristae منتظم. بدلا من ذلك ، تتراكم حويصلات الغشاء الداخلي دون اتصال بغشاء الحدود الداخلية19 ، 20. الأهم من ذلك ، يتم الحفاظ على MICOS في الشكل والوظيفة من الخميرة إلىالإنسان 21. يؤكد ارتباط الطفرات في الوحدات الفرعية MICOS بالأمراض البشرية الشديدة أيضا على أهميتها لحقيقيات النوى الأعلى22,23. على الرغم من أن MICOS متعدد الاستخدامات للغاية ، يجب أن توجد مواقع اتصال إضافية (بناء على ملاحظاتنا غير المنشورة). في الواقع ، تم تحديد العديد من مواقع الاتصال الأخرى ، على سبيل المثال ، آلات اندماج الميتوكوندريا Mgm1-Ugo1 / Fzo124،25،26 أو Mdm31-Por1 ، والتي تشارك في التخليق الحيوي للفوسفوليبيد الكارديوليبين27 الخاص بالميتوكوندريا. في الآونة الأخيرة ، قمنا بتحسين الطريقة التي قادتنا إلى تحديد MICOS لتحديد Cqd1 كجزء من موقع اتصال جديد تم تشكيله مع مجمع الغشاء الخارجي Por1-Om1428. ومن المثير للاهتمام ، يبدو أن موقع الاتصال هذا يشارك أيضا في عمليات متعددة مثل توازن غشاء الميتوكوندريا ، واستقلاب الفوسفوليبيد ، وتوزيع الإنزيم المساعد Q28,29.
هنا ، استخدمنا اختلافا في التجزئة الموصوفة سابقا للميتوكوندريا9،30،31،32،33. تؤدي المعالجة الاسموزية للميتوكوندريا إلى تعطيل الغشاء الخارجي للميتوكوندريا وانكماش مساحة المصفوفة ، تاركة الغشاءين على مقربة فقط في مواقع الاتصال. وهذا يسمح لتوليد الحويصلات التي تتكون حصرا من الغشاء الخارجي الميتوكوندريا أو الغشاء الداخلي الميتوكوندريا أو في تحتوي على مواقع الاتصال من كلا الغشاء من خلال صوتنة خفيفة. نظرا لأن الغشاء الداخلي للميتوكوندريا يحتوي على نسبة بروتين إلى دهون أعلى بكثير ، فإن حويصلات الغشاء الداخلي للميتوكوندريا تظهر كثافة أعلى مقارنة بحويصلات الغشاء الخارجي للميتوكوندريا. يمكن استخدام الفرق في الكثافة لفصل الحويصلات الغشائية من خلال الطرد المركزي المتدرج لكثافة السكروز الطافية. وهكذا ، تتراكم حويصلات الغشاء الخارجي للميتوكوندريا بتركيزات منخفضة من السكروز ، بينما يتم إثراء حويصلات الغشاء الداخلي للميتوكوندريا بتركيزات عالية من السكروز. تتركز الحويصلات التي تحتوي على مواقع التلامس بتركيزات السكروز المتوسطة (الشكل 2). يصف البروتوكول التالي هذه الطريقة المحسنة ، والتي تتطلب معدات ووقتا وطاقة أقل تخصصا مقارنة ببروتوكولنا الذي أنشأناهسابقا 32 ، بالتفصيل ويوفر أداة مفيدة لتحديد بروتينات موقع الاتصال المحتملة.
Protocol
Representative Results
Discussion
تجزئة الميتوكوندريا هي تجربة معقدة مع عدة خطوات معقدة للغاية. لذلك ، كنا نهدف إلى زيادة تحسين ، وإلى حد ما ، تبسيط طريقتنا32 المعمول بها. هنا ، كانت التحديات هي الحاجة إلى معدات معقدة ومتخصصة للغاية ، والتي غالبا ما تكون إنشاءات فردية ، والوقت الهائل واستهلاك الطاقة. تحقيقا لهذ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تعترف M.E.H. بالدعم المالي للمؤسسة الألمانية (DFG) ، المشروع رقم 413985647. يشكر المؤلفون الدكتور مايكل كيبلر ، جامعة لودفيغ ماكسيميليان ، ميونيخ ، على دعمه السخي والواسع. نحن ممتنون لوالتر نيوبرت على مدخلاته العلمية ومناقشاته المفيدة وإلهامه المستمر. JF يشكر كلية الدراسات العليا لعلوم الحياة في ميونيخ (LSM) على الدعم.
Materials
| 13.2 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 14 x 89mm | Beckman Instruments, Germany | 344059 | |
| 50 mL, Open-Top Thickwall Polycarbonate Open-Top Tube, 29 x 104mm | Beckman Instruments, Germany | 363647 | |
| A-25.50 Fixed-Angle Rotor- Aluminum, 8 x 50 mL, 25,000 rpm, 75,600 x g | Beckman Instruments, Germany | 363055 | |
| Abbe refractometer | Zeiss, Germany | discontinued, any pipet controller will suffice |
|
| accu-jet pro Pipet Controller | Brandtech, USA | BR26320 | discontinued, any pipet controller will suffice |
| Beaker 1000 mL | DWK Life Science, Germany | C118.1 | |
| Branson Digital Sonifier W-250 D | Branson Ultrasonics, USA | FIS15-338-125 | |
| Branson Ultrasonic 3mm TAPERED MICROTIP | Branson Ultrasonics, USA | 101-148-062 | |
| Branson Ultrasonics 200- and 400-Watt Sonifiers: Rosette Cooling Cell | Branson Ultrasonics, USA | 15-338-70 | |
| Centrifuge Avanti JXN-26 | Beckman Instruments, Germany | B37912 | |
| Centrifuge Optima XPN-100 ultra | Beckman Instruments, Germany | 8043-30-0031 | |
| cOmplete Proteaseinhibtor-Cocktail | Roche, Switzerland | 11697498001 | |
| D-Sorbit | Roth, Germany | 6213 | |
| EDTA (Ethylendiamin-tetraacetic acid disodium salt dihydrate) | Roth, Germany | 8043 | |
| Erlenmeyer flask, 100 mL | Roth, Germany | X747.1 | |
| graduated pipette, Kl. B, 25:0, 0.1 | Hirschmann, Germany | 1180170 | |
| graduated pipette, Kl. B, 5:0, 0.05 | Hirschmann, Germany | 1180153 | |
| ice bath | neoLab, Germany | S12651 | |
| Magnetic stirrer RCT basic | IKA-Werke GmbH, Germany | Z645060GB-1EA | |
| MOPS (3-(N-Morpholino)propanesulphonic acid) | Gerbu, Germany | 1081 | |
| MyPipetman Select P1000 | Gilson, USA | FP10006S | |
| MyPipetman Select P20 | Gilson, USA | FP10003S | |
| MyPipetman Select P200 | Gilson, USA | FP10005S | |
| Omnifix 1 mL | Braun, Germany | 4022495251879 | |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Serva, Germany | 32395.03 | |
| STERICAN cannula 21 Gx4 4/5 0.8×120 mm | Braun, Germany | 4022495052414 | |
| stirring bar, 15 mm | VWR, USA | 442-0366 | |
| Sucrose | Merck, Germany | S8501 | |
| SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Instruments, Germany | 331362 | |
| Test tubes | Eppendorf, Germany | 3810X | |
| Tissue grinders, Potter-Elvehjem type, 2 mL glass vessel | VWR, USA | 432-0200 | |
| Tissue grinders, Potter-Elvehjem type, 2 mL plunger with serrated tip | VWR, USA | 432-0212 | |
| Trichloroacetic acid (TCA) | Sigma Aldrich, Germany | 33731 | discontinued, any TCA will suffice (CAS: 73-03-9) |
| TRIS | Roth, Germany | 4855 |
References
- Braymer, J. J., Freibert, S. A., Rakwalska-bange, M., Lill, R. BBA – Molecular Cell Research Mechanistic concepts of iron-sulfur protein biogenesis in Biology * General concepts of FeS protein biogenesis. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Molecular Cell Research. 1868 (1), 118863 (2021).
- Osman, C., Merkwirth, C., Langer, T. Prohibitins and the functional compartmentalization of mitochondrial membranes. Journal of Cell Science. 122 (21), 3823-3830 (2009).
- Smaili, S. S., Hsu, Y., Youle, R. J., Russell, J. T. Mitochondria in Ca 2 %. Signaling and Apoptosis. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 32 (1), (2000).
- Rolland, S. G., Conradt, B. New role of the BCL2 family of proteins in the regulation of mitochondrial dynamics. Current Opinion in Cell Biology. 22 (6), 852-858 (2011).
- Palade, G. E. An electron microscope study of the mitochondrial structure. The journal of histochemistry and cytochemistry: official journal of the Histochemistry Society. 1 (4), 188-211 (1953).
- Hackenbrock, C. R. Ultrastructural bases for metabolically linked mechanical activity in mitochondria. I. Reversible ultrastructural changes with change in metabolic steady state in isolated liver mitochondria. The Journal of cell biology. 30 (2), 269-297 (1966).
- Hackenbrock, C. R. Chemical and physical fixation of isolated mitochondria in low-energy and high-energy states. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 61 (2), 598-605 (1968).
- Reichert, A. S., Neupert, W. Contact sites between the outer and inner membrane of mitochondria – Role in protein transport. Biochimica et Biophysica Acta – Molecular Cell Research. 1592 (1), 41-49 (2002).
- Harner, M., et al. The mitochondrial contact site complex, a determinant of mitochondrial architecture. EMBO Journal. 30 (21), 4356-4370 (2011).
- Hoppins, S., et al. A mitochondrial-focused genetic interaction map reveals a scaffold-like complex required for inner membrane organization in mitochondria. Journal of Cell Biology. 195 (2), 323-340 (2011).
- vonder Malsburg, K., et al. Dual Role of Mitofilin in Mitochondrial Membrane Organization and Protein Biogenesis. Developmental Cell. 21 (4), 694-707 (2011).
- Bohnert, M., et al. Role of mitochondrial inner membrane organizing system in protein biogenesis of the mitochondrial outer membrane. Molecular Biology of the Cell. 23 (20), 3948-3956 (2012).
- Darshi, M., et al. ChChd3, an inner mitochondrial membrane protein, is essential for maintaining Crista integrity and mitochondrial function. Journal of Biological Chemistry. 286 (4), 2918-2932 (2011).
- Körner, C., et al. The C-terminal domain of Fcj1 is required for formation of crista junctions and interacts with the TOB/SAM complex in mitochondria. Molecular Biology of the Cell. 23 (11), 2143-2155 (2012).
- Xie, J., Marusich, M. F., Souda, P., Whitelegge, J., Capaldi, R. A. The mitochondrial inner membrane protein Mitofilin exists as a complex with SAM50, metaxins 1 and 2, coiled-coil-helix coiled-coil-helix domain-containing protein 3 and 6 and DnaJC11. FEBS Letters. 581 (18), 3545-3549 (2007).
- Zerbes, R. M., et al. Role of MINOS in mitochondrial membrane architecture: Cristae morphology and outer membrane interactions differentially depend on mitofilin domains. Journal of Molecular Biology. 422 (2), 183-191 (2012).
- Modi, S., et al. Miro clusters regulate ER-mitochondria contact sites and link cristae organization to the mitochondrial transport machinery. Nature Communications. 10 (1), 4399 (2019).
- Khosravi, S., Harner, M. E. The MICOS complex, a structural element of mitochondria with versatile functions. Biological Chemistry. 401 (6-7), 765-778 (2020).
- John, G. B., et al. The mitochondrial inner membrane protein mitofilin controls cristae morphology. Molecular Biology of the Cell. 16 (3), 1543-1554 (2005).
- Rabl, R., et al. Formation of cristae and crista junctions in mitochondria depends on antagonism between Fcj1 and Su e/g. Journal of Cell Biology. 185 (6), 1047-1063 (2009).
- Alkhaja, A. K., et al. MINOS1 is a conserved component of mitofilin complexes and required for mitochondrial function and cristae organization. Molecular Biology of the Cell. 23 (2), 247-257 (2012).
- Eramo, M. J., Lisnyak, V., Formosa, L. E., Ryan, M. T. The "mitochondrial contact site and cristae organising system" (MICOS) in health and human disease. Journal of Biochemistry. 167 (3), 243-255 (2020).
- Ikeda, A., Imai, Y., Hattori, N. Neurodegeneration-associated mitochondrial proteins, CHCHD2 and CHCHD10-what distinguishes the two. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 1-12 (2022).
- Sesaki, H., Southard, S. M., Yaffe, M. P., Jensen, R. E. Mgm1p, a dynamin-related GTPase, is essential for fusion of the mitochondrial outer membrane. Molecular Biology of the Cell. 14 (6), 2342-2356 (2003).
- Fritz, S., Rapaport, D., Klanner, E., Neupert, W., Westermann, B. Connection of the mitochondrial outer and inner membranes by Fzo1 is critical for organellar fusion. Journal of Cell Biology. 152 (4), 683-692 (2001).
- Wong, E. D., et al. The intramitochondrial dynamin-related GTPase, Mgm1p, is a component of a protein complex that mediates mitochondrial fusion. Journal of Cell Biology. 160 (3), 303-311 (2003).
- Miyata, N., Fujii, S., Kuge, O. Porin proteins have critical functions in mitochondrial phospholipid metabolism in yeast. Journal of Biological Chemistry. 293 (45), 17593-17605 (2018).
- Khosravi, S., et al. The UbiB family member Cqd1 forms a novel membrane contact site in mitochondria. J Cell Sci. , (2023).
- Kemmerer, Z. A., et al. UbiB proteins regulate cellular CoQ distribution in Saccharomyces cerevisiae. Nature Communications. 12 (1), 4769 (2021).
- Pon, L., Moll, T., Vestweber, D., Marshallsay, B., Schatz, G. Protein import into mitochondria: ATP-dependent protein translocation activity in a submitochondrial fraction enriched in membrane contact sites and specific proteins. Journal of Cell Biology. 109, 2603-2616 (1989).
- Lithgow, T., Timms, M., Hj, P. B., Hoogenraad, N. J. Identification of a GTP-binding protein in the contact sites between inner and outer mitochondrial membranes. Biochemical and Biophysical Research Communications. 180 (3), 1453-1459 (1991).
- Harner, M. Isolation of contact sites between inner and outer mitochondrial membranes. Methods in Molecular Biology. 1567, 43-51 (2017).
- Adams, V., Bosch, W., Schlegel, J., Wallimann, T., Brdiczka, D. Further characterization of contact sites from mitochondria of different tissues: topology of peripheral kinases. BBA – Biomembranes. 981 (2), 213-225 (1989).
- Izawa, T., Unger, A. K. Isolation of mitochondria from Saccharomyces cerevisiae. Methods in Molecular Biology. 1567, 33-42 (2017).
- Gregg, C., Kyryakov, P., Titorenko, V. I. Purification of mitochondria from yeast cells. Journal of Visualized Experiments. (30), 17-19 (2009).
- Beavis, A. D., Brannan, R. D., Garlid, K. D. Swelling and Contraction of the Mitochondrial Matrix I. A structural interpretation of the relationship between light scattering and matrix volume. Journal of Biological Chemistry. 260 (25), 13424-13433 (1985).
- Born, M., Wolf, E. . Principles of optics electromagnetic theory of propagation, interference and diffraction of light. , (1999).
- Koontz, L. TCA precipitation. Methods in Enzymology. 541, 3-10 (2014).
- Laemmli, U. K. Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Renart, J., Reiser, J., Stark, G. R. Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: A method for studying antibody specificity and antigen structure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (7), 3116-3120 (1979).
- Al-Tubuly, A. A. SDS-PAGE and Western Blotting. Methods Mol Med. 40, 391-405 (2000).
- Kurien, B. T., Hal Scofield, R. Western blotting: Methods and protocols. Western Blotting: Methods and Protocols. (3), 1 (2015).
- Gallagher, S., Chakavarti, D. Immunoblot analysis. Journal of Visualized Experiments. (16), (2008).
- Sherman, F. Getting Started with Yeast. Methods in Enzymology. 194, 3-21 (1991).
- Howson, R., et al. Construction, verification and experimental use of two epitope-tagged collections of budding yeast strains. Comparative and Functional Genomics. 6 (1-2), 2-16 (2005).
- Knop, M., et al. Epitope tagging of yeast genes using a PCR-based strategy: More tags and improved practical routines. Yeast. 15, 963-972 (1999).
- Longtine, M. S., et al. Additional modules for versatile and economical PCR-based gene deletion and modification in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 14 (10), 953-961 (1998).
- Tsai, P. I., et al. PINK1 Phosphorylates MIC60/Mitofilin to Control Structural Plasticity of Mitochondrial Crista Junctions. Molecular Cell. 69 (5), 744-756 (2018).
- Xiao, T., et al. Identification of CHCHD10 Mutation in Chinese Patients with Alzheimer Disease. Molecular Neurobiology. 54 (7), 5243-5247 (2017).
- Bannwarth, S., et al. A mitochondrial origin for frontotemporal dementia and amyotrophic lateral sclerosis through CHCHD10 involvement. Brain. 137 (8), 2329-2345 (2014).
- Chaussenot, A., et al. Screening of CHCHD10 in a French cohort confirms the involvement of this gene in frontotemporal dementia with amyotrophic lateral sclerosis patients. Neurobiology of Aging. 35 (12), 1-4 (2014).
- Chiò, A., et al. CHCH10 mutations in an Italian cohort of familial and sporadic amyotrophic lateral sclerosis patients. Neurobiology of Aging. 36 (4), 3-6 (2015).
- Genin, E. C., et al. CHCHD 10 mutations promote loss of mitochondrial cristae junctions with impaired mitochondrial genome maintenance and inhibition of apoptosis. EMBO Molecular Medicine. 8 (1), 58-72 (2016).
- Bannwarth, S., et al. A mitochondrial origin for frontotemporal dementia and amyotrophic lateral sclerosis through CHCHD10 involvement. Brain. 137 (8), 2329-2345 (2014).
