凍結肩甲ラットモデルの推拿:効率的で再現性のあるプロトコル

この研究は、山東中医薬大学付属病院の倫理委員会によって承認されました(番号:AWE-2022-023)。 1. 実験動物 20匹の雄のSprague-Dawley(SD)ラット(7週齢、250-280g)を標準条件(室温[RT] 20-24°C、湿度40%-60%、および12時間/12時間の明暗サイクル)で飼育した。 2. グルーピング方法 SDラットを対照群(C)、FSモデル対照群(M)、FSモデル推拿治療群(MT)、FSモデル経口治療群(MO)にグループ化し、それぞれ5匹のラットからなる。ケージごとに5匹のラットを飼育します(同じグループ)。 7日間の順応後、M、MT、およびMOグループのラットの片方の肩を石膏模型固定化を使用して3週間固定し、次のセクションで説明するようにFSを模倣します。 セクション4(図1)に記載されているように、MT群のラットに2週間推拿療法を投与します。 成人の投与量(0.75 mg /日)とラットの人体表面積の比率(0.018)に基づいて、ラットのキログラムあたりのデキサメタゾンの必要投与量(0.0675 mg /日)を計算します。. MO群のラットに0.067 mg/kg/dayの胃内デキサメタゾン溶液を午前7:00に2週間毎日投与します。注:この研究におけるTuinaプロトコルの効果を確認するために、このグループ化方法を使用してください。さまざまな研究で実験目的に従ってグループ化方法を実行します。 3. FSモデルの開発 トリブロモエタノール(250 mg / kg、腹腔内注射による)を使用してラットを麻酔します11。注:施設の倫理委員会の要件に従って、トリボモエタノール(10 g)とtert-アミルアルコール(10 mL)からなるストック溶液を4°Cで保存しました。 使用前に、蒸留水で2%に希釈した。 ラットの右肩と胸に絆創膏を染み込ませ、右前肢を肩関節の内旋90°に3週間維持します(図2)12。注意: ラットを監視して、歩行、食事、飲酒などの正常な生理学的活動を実行できることを確認します。ラットが正常な生理学的活動を実行できない場合は、石膏包帯を固定します。 ラット13において、右肩関節のこわばり、右上肢の収縮、筋萎縮、足を引きずるなどの症状の発現を観察し、FSモデルの確立に成功したことを確認する。 4.推拿法 注:手順全体を通して、調査員は個人用保護具を着用する必要があります。すべての操作を行う必要があるのは、1人の専門の推拿医師だけです(図3、図 4、 および図5)。 機械受容器とコンピュータを含むインテリジェントマッサージ技術パラメータ決定システムによってトレーニングします(図3A)。機械受容器と力のパラメータをソフトウェアで表示した3方向の操作を行います(図3B)。 親指を使用して、0.5 kgの強度と100〜120回/分の頻度で回転運動で回転混練法を実行します(図3C)。 親指の指先を使用して、0.5kgの強さでポイントプレス法を実行します(図3D)。 ステップ4.1.2および4.1.3で述べた機械的表示を1分間維持することにより、ラットにトゥイナを実行します。 ネズミが落ち着くまで(~2分)保持します。次に、操作を実行します。ラットを横臥位にしますが、操作方法によって位置が変わる場合があります。 右手の人差し指と中指でラットの右前肢を挟み、何度か曲げて伸ばし、ラットの肩関節、肘関節、上腕骨の位置を決めます。 ラットの右肩、前肢、背中を親指の果肉で時計回りに0.5kgの強さと100〜120回/分の頻度で3分間こねます(図4A-C)。横臥位で前肢の筋肉を操作します。 うつ伏せの姿勢で肩と背中の筋肉を操作します。 ツボLI15(Jianyu)、SI11(Tianzong)、HT01(Jiquan)、LI11(Quchi)を親指先でツボごとに30回、0.5kgの強さで垂直に押します(図4D-G)。ラット経穴アトラスを使用して、各経穴の位置を定義します(図5)14,15。 肩峰端の前方下方のくぼみにあるLI15を腹臥位で押します。 肩甲骨脊椎の中点にある棘下窩のくぼみにあるSI11を腹臥位で押します。 腋窩の中心にあるHT01を仰臥位で押します。 横臥位で肘骨折り目の外側端にある橈骨手根伸筋の内側にあるくぼみLI11を押します。 左手の親指と中指で肩関節を持ち、前肢を内転、外転、前方伸展、後伸展の姿勢で10秒間伸ばします(図4H-K)。注:この延伸方法は、ラットでは抵抗なく実行する必要があります。 ラットが興奮した場合は、推拿手順を一時停止します。.ラットを10秒間撫でて落ち着かせてから、試験を進めます。 手順を2週間毎日実行します。 5.肩甲上腕骨ROMの測定 注意: 関節包組織の変性を防ぐために、測定プロセスをできるだけ早く完了することが重要です。 肩甲骨の下端を露出させ、トリブロモエタノールの過剰投与量(腹腔内注射による初期用量の3倍)でラットを犠牲にした後、肩甲骨と上腕骨の近位3分の2を一括して除去します。. 注射針(1.2cm×0.45mm)を上腕骨軸に沿って上腕骨頭に挿入します。 滅菌手術用シートで包まれたプラスチックフォームの肩甲骨の上下の角に2本の注射針を垂直に挿入します。 上腕骨軸の注射針に細い糸を取り付け、上腕骨軸と平行になるように5gの力でもう一方の端を引っ張ります。肩甲骨の下端と上腕骨軸の間の角度を測定します(図6)。注:信頼性の高い結果を確保するために、別の調査員に測定を行ってもらいます。 統計分析ソフトウェアアプリケーションを使用して、データを平均±標準偏差(SD)として報告します。注: ここでは、SPSS ソフトウェア (SPSS、バージョン 25.0) を使用しました。 一元配置分散分析 (ANOVA) を使用してグループ間の差を分析します。 適切なソフトウェアを使用してバーグラフィックを取得します。注:ここではGraphPad Prism 8を使用しました。 測定後にH&EおよびMasson染色を使用してカプセルの病理を評価します。 6. 切片の準備 肩甲上腕骨ROMを評価した後、全サンプルを4%PFAで3日間固定し、続いてEDTA(pH 7.2)溶液でさらに2か月間脱灰します。 脱水後、サンプルを含む包埋組織ブロックを5μmスライス16にスライスする。 スライスを65°Cで60分間乾燥させます。 スライスを脱ワックスします。 スライスをキシレンI、キシレンII、キシレンIIIに7分間浸し、続いて下降エタノール系列(無水エタノール、5分、95%エタノール、2分、80%エタノール、2分、70%エタノール、2分)、最後に超純水に2分間浸します。 7. H&E染色 ヘマトキシリンで切片を5分間染色し、1%塩酸エタノールで3秒間すすぎ、流水で5分間洗浄します。 切片をエオシンで3分間染色し、水道水で洗います。 切片をエタノール系列(95%エタノールI、3秒、95%エタノールII、3秒、無水エタノールI、3秒、無水エタノールII、1分)に浸漬し、次にキシレン系列(キシレンI、1分、キシレンII、1分)に浸漬します。 各サンプルに中性ガムシーラントを一滴垂らします。各サンプルをカバーガラスで密封します。 倒立蛍光顕微鏡(スケールバー=100μm)を用いて画像を収集します。 8.マッソン染色 免疫組織化化学ペンを使用して、切片の周囲に円を描き、Bouin溶液中で切片を37°Cで2時間インキュベートして媒染剤にします。続いて、黄色が消えるまで切片を水で洗います。 サンプルをラピスラズリブルー染料で3分間処理した後、蒸留水で洗浄します。 切片をヘマトキシリン(Mayer)で2分間染色した後、切片を酸性エタノール分化溶液で3秒間処理します。次に、流水で10分間セクションを洗浄します。 切片をポンソーマゼンタ染料溶液で10分間染色し、続いて水で洗浄します。 切片をリンモリブデン酸溶液に10分間浸します。 切片にアニリンブルー染色液を5分間添加し、弱酸性作動液で2分間洗浄します。 脱水し、手順7.3の説明に従って切片を透明にします。 各セクションに中性ガムシーリング剤を一滴垂らし、カバーガラスで覆います。セクションをドラフトに入れたままにして乾かします。 手順 7.5 の説明に従って画像を収集します。