Ontwerp en bouw van een aanpasbare, single-objectief, light-sheet fluorescentiemicroscoop voor de visualisatie van cytoskeletnetwerken

1. Voorbereiding op de uitlijning Voordat u met de bouw begint, voert u de nodige literatuuronderzoeken uit om een duidelijk beeld te krijgen van de beoogde use case (bijv. de fluoroforen die moeten worden afgebeeld, het benodigde beeldvolume, de resolutievereisten). Raadpleeg in het bijzonder het gedeelte over representatieve resultaten hieronder om te beslissen of het passend is om het exacte ontwerp te volgen dat hier wordt beschreven. Als dit het geval is, gaat u verder met stap 1.2. Als dit niet het geval is, vindt u suggesties en richtlijnen voor hardwareselectie in de Sheunglab SOLS Build Guide23.OPMERKING: De gebruiker kan meer informatie vinden over de specificaties van dit specifieke systeem in de discussiesectie. Verzamel alle benodigde optische, optomechanische en elektrische componenten zoals beschreven in de Materiaaltabel. Voor gebruikers die het systeem aanpassen, verzamel alle equivalente onderdelen. Bouw de uitlijnlaser zoals afgebeeld in afbeelding 2A. Controleer of de balk is gecollimeerd met behulp van de afschuifplaat. Bouw de dubbele matglazen schijfuitlijnkooi zoals afgebeeld in afbeelding 2B. Bereid het fluorescerende testmonster met kleurstofcoating voor.Maak een verzadigde rhodamine-kleurstofoplossing door geleidelijk 1 ml gedestilleerd water toe te voegen aan 0,2 g gevriesdroogd poeder totdat alles is opgelost. Vortex om te homogeniseren.NOTITIE: Deze oplossing is lichtgevoelig. Hoewel er tijdens de bereiding geen voorzorgsmaatregelen nodig zijn, moet u ervoor zorgen dat de oplossing na bereiding in een donkere ruimte wordt bewaard.LET OP: Draag altijd handschoenen en een masker bij het hanteren van rhodaminepoeder. Pipetteer 10 μl op het midden van een testglaasje. Plaats een dekglas van 22 mm x 22 mm op de vloeistof en zorg ervoor dat de fluorescentielaag zo dun mogelijk is. Sluit af met doorzichtige nagellak.OPMERKING: Dit monster is lichtgevoelig. Om de levensduur van het monster te maximaliseren, moet u ervoor zorgen dat het objectglaasje in een donkere ruimte wordt bewaard wanneer het niet in gebruik is. Bereid het 3D-parelmonster voor (1 μm kralen ingebed in gel).Gebruik dubbelzijdige tape om een verticaal kanaal van 4-5 mm breed te maken op een monsterglaasje met drie lagen tape hoog. Plaats een dekglas van 22 mm x 22 mm op de tape in het midden van het objectglaasje. Druk stevig op de afgeplakte delen om een goede afdichting tussen de tape en het afdekglas te garanderen. Gebruik een scheermesje om de overtollige tape te verwijderen. Bereid 125 ml verzadigde gellangomoplossing door geleidelijk DI-water toe te voegen aan 1 g gellangompoeder. Deze oplossing is vast bij kamertemperatuur en vloeibaar bij 65 °C. Breng 1 ml gellangomoplossing in een microcentrifugebuis. Verwarm een bak met water op een kookplaat van 65 °C en verwarm de microcentrifugebuis tot de gellangom zichtbaar stroperig is. Bereid 10 μl van een verdunning van 1:1.000 parels in een verwarmde gellangomoplossing. Pipetteer de oplossing voorzichtig in de kamer tot deze vol is. Gebruik een tandenstoker om een kleine hoeveelheid epoxy aan beide zijden van het kanaal te deppen en de openingen volledig te bedekken om af te dichten. Om een goede afdichting te garanderen, inspecteert u beide uiteinden visueel om er zeker van te zijn dat de epoxy lichtjes in elk uiteinde van het kanaal is doorgedrongen. Figuur 2: Foto’s van de uitlijningsgereedschappen. (A) Laser voor collimitatie. AL1: Uitlijningslens 1, −50 mm; AL2: Uitlijningslens 2, 100 mm (B) Dubbele matglazen schijfuitlijnkooi. Afkortingen: RMS CP = RMS schroefdraad kooiplaat; SM1 CP = SM1 kooiplaat met schroefdraad. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. 2. Het excitatiepad uitlijnen Schets de lay-out van de microscoop op het oppervlak van de optische tafel. Meet alle afstanden zo nauwkeurig mogelijk.NOTITIE: Raadpleeg afbeelding 3 voor de locatie van de componenten in het systeem. Monteer de excitatielaser op de tafel. Stel twee irissen in op de beoogde hoogte van de laser en monteer ze 2-3 ft uit elkaar op de gewenste lijn van gaten achter de locatie van spiegel 1 (M1). Gebruik deze irissen om ervoor te zorgen dat de straal gelijk is met het tafeloppervlak en gecentreerd is op de gatenlijn op de optische tafel.NOTITIE: Draag een laserveiligheidsbril ter bescherming van de ogen en blokkeer eventuele verdwaalde laserstralen met laserveiligheidsschermen als veiligheidsmaatregel. Totdat alle componenten permanent zijn vastgeklemd, is drift in de orde van uren mogelijk. Stel aan het einde van elke dag een iris in op het verste punt van de uitlijning als een snelle visuele controle op drift bij het terugkeren naar de build. Trillingen, een niet goed zwevende optische tafel en luchtstromen zijn de meest voorkomende oorzaken van optische drift. Monteer de lasersluiter zo dicht mogelijk bij de excitatielaser. Gebruik deze sluiter om het laserlicht snel te blokkeren tijdens het uitlijnen, in plaats van de laser herhaaldelijk aan en uit te zetten. Monteer de ND-filters in het ND-filterwiel (ND 0.5, 1.0. 2.0, 3.0, 4.0 en een lege sleuf) en monteer ze na de lasersluiter. Schakel de gemotoriseerde actuator naar één translatietrap (TS1) en plaats de trap vervolgens onder de locatie van M1. Zorg ervoor dat de tafel axiaal vertaalt langs dezelfde lijn van gaten die het laserlicht volgt. Plaats de tafel in het midden van het bereik voor de eerste plaatsing.In de volgende stappen 2.6-2.10 steekt u de reflecterende optische componenten één voor één in het straalpad om de laser langs het pad te richten zoals op de tafel getekend. Gebruik het paar irissen dat op de exacte hoogte is ingesteld om het gewenste pad van de uitgangsstraal te definiëren en de plaatsing en uitlijning van elk reflecterend element te begeleiden. Pas voor elk element de hoogte en positie van de houder aan om ervoor te zorgen dat de inkomende straal het midden raakt. Draai vervolgens de basis van de houder om de straal langs het uitgesponnen straalpad op de tafel te richten, zodat deze door beide irissen gaat, en pas de kanteling van de uitgaande balk nauwkeurig aan met de knoppen aan de achterkant van elke houder.NOTITIE: Nadat elk element op de juiste hoogte is uitgelijnd, voegt u een slip-on kraag toe aan de paal om de hoogte vast te zetten. Monteer en lijn M1 uit bovenop TS1. Monteer en lijn de dichroïsche op de tafel. Volg de instructies van de fabrikant en sluit de galvo aan op de voeding en de functiegenerator. Monteer de galvo zodanig dat de laser precies in het midden van de spiegel valt. Schakel de galvo in en houd vervolgens de AM-knop op de golfvormgenerator ingedrukt om de spiegelkanteling in te stellen op 0 V gelijkstroom (midden van het bereik). Lijn nu de galvo uit met de irissen. Monteer en lijn spiegel 2 (M2) uit. Plaats de grote cilindrische spiegel in de cilindrische spiegelbevestiging. Gebruik 1 in kooistangen om een kooiadapter van 30-60 mm boven spiegel 3 (M3) te bevestigen. Gebruik de knoppen op de spiegelbevestiging om de kanteling van de M3-spiegel af te vlakken voor de eerste plaatsing. Monteer de dubbele, matglazen uitlijnkooi in de kooiadapter boven M3; Zorg ervoor dat u de stelschroeven op de kooiadapter vastdraait die de uitlijnkooi op zijn plaats houden elke keer dat deze wordt gebruikt voor uitlijning. Monteer de M3 op de tafel en pas de hoogte en positie aan totdat de balk ongeveer gecentreerd is op beide matglazen uitlijnschijven. Klem M3 op de tafel en gebruik een paalbevestiging, 3 in paal, 90° klem en 2 in paal aan beide zijden van M3 om ondersteuning toe te voegen met behulp van de afgeplakte gaten aan weerszijden van de spiegelbevestiging. Gebruik de knoppen aan de achterkant van de spiegel om de lichtbundel fijn af te stellen.NOTITIE: Alle reflecterende elementen in het excitatiepad zijn nu ingesteld en mogen niet worden aangeraakt. Monteer lens 1 (L1) op de tafel. Gebruik voor alle initiële lensplaatsingen een opschroefbaar lensdoel om de inkomende straal op de voorkant van de lens te centreren. Pas de kanteling en zijwaartse positie van lens 1 (L1) aan totdat de straal gecentreerd is op beide matglasplaten op de uitlijnkooi boven M3. Monteer lens 2 (L2) in de respectievelijke positie om een 4f-systeem met L1 te creëren. Beweeg L2 axiaal om een gecollimeerde straal te verkrijgen en gebruik de excitatielaser en de afschuifplaat om de collimatie te controleren. Pas de kanteling en zijdelingse positie van L2 aan om de straal te centreren op beide matglazen schijven boven M3. Monteer het gaatje in een xy-vertaalpasse-partoute. Monteer deze bovenop een 1D-vertaaltafel om een fijne axiale vertaling te verkrijgen. Monteer het gaatje en de objecttafel op een paal en paalbevestiging en plaats deze op het gedeelde brandpunt tussen L1 en L2. Stel het gaatje met de hand af totdat het laserlicht door het gaatje heen te zien is. Monteer de sensor van de vermogensmeter onmiddellijk na het gaatje en gebruik de golflengteknop op de digitale console van de vermogensmeter om de golflengte van de excitatielaser te selecteren. Pas de xy-positie van het gaatje aan om de transmissie te maximaliseren en een bijna TEM00-straalprofiel te verkrijgen. Pas vervolgens het gaatje axiaal aan met de 1D-trap om de transmissie verder te maximaliseren. Monteer lens 4 (L4) op de tafel en stel de houder in op de juiste hoogte. Stel L4 axiaal in zodat de excitatiestraal op het oppervlak van de galvo is gericht. Pas de kanteling en zijdelingse positie van L4 aan om de straal te centreren op beide matglazen schijven boven M3. Monteer lens 3 (L3) op de tafel in zijn positie en stel de houder in op de juiste hoogte. Gebruik de excitatielaser en de afschuifplaat om de collimatie van L3 en L4 te controleren. Pas de kanteling en zijwaartse positie van L3 aan om de straal te centreren op beide matglazen schijven boven M3. Verwijder L3 tijdelijk. Monteer Scan Lens 1 (SL1) op de tafel en pas de axiale afstand aan om een gecollimeerde telescoop met L4 te vormen, zoals gemeten met de schuifplaat. Pas de kanteling en zijwaartse positie van SL1 aan om de straal te centreren op beide matglazen schijven boven M3. Plaats L3 terug. Monteer buislens 1 (TL1) en gebruik de excitatiestraal en afschuifplaat om SL1 en TL1 te collimeren. Pas de kanteling en zijdelingse positie van TL1 aan om de straal te centreren op beide matglazen schijven boven M3. Schroef met behulp van een adapterring objectief 1 (O1) in de kooiplaat boven M3. Verwijder SL1 tijdelijk en laat de balk het plafond raken. Pas de hoogte (axiale afstand) van O1 op het kooisysteem aan totdat de balk een luchtige schijf aan het plafond vormt en ga dan door met aanpassen totdat de grootte van de schijf is geminimaliseerd. Met O1 op zijn plaats, monteert u de monstertafel in de juiste positie. Figuur 3: Locatie van de componenten binnen het SOLS-systeem. (A) Schematische lay-out van het SOLS-systeem met alle componenten gelabeld. (B) Top-down foto van het fysieke SOLS-systeem op de optische tafel, met uitzondering van het gebied van de monsterfase. (C) Foto van bovenaf van het gebied van de monstertafel (uitbreiding van figuur 3B). Het excitatiepad wordt in het groen weergegeven. Het emissiepad wordt in rood weergegeven. Brandpuntsafstanden van de lenzen: L1: 100 mm; L2: 45 mm; CL1: 50 mm; CL2: 200 mm; CL3: 100 mm; L3:150 mm; L4: 100 mm; SL1: 75 mm; TL1: 200 mm; SL2: 150 mm; TL2: 125 mm; TL3: 200 mm. Zie de materiaaltabel voor meer gedetailleerde onderdeelspecificaties. Afkortingen: SOLS = single-objective light-sheet; ND-wiel = filterwiel met variabele neutrale dichtheid; L1-L4 = vlakke concave achromatische lenzen; CL1-CL3 = cilindrische lenzen; M1-M3 = spiegels; TS1-TS2 = vertaalstadia; DM = dichroïsche spiegel; Galvo = scanning galvanometer; SL1-SL2 = lenzen scannen; TL1-TL2 = buislenzen; O1-O3 = doelstellingen; EF = emissiefilter. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. 3. Uitlijnen van het emissiepad Stel de uitlijnlaser in.Monteer twee lege kooiplaten naast de excitatielaser op dezelfde hoogte als de laser. Gebruik deze kooiplaten om de uitlijnlaser te monteren door de kooistangen van de uitlijnlaser in de lege gaten in de twee kooiplaten te schuiven. Zorg ervoor dat de laser in de aan-stand kan worden gezet, hetzij door de aan/uit-knop af te plakken, hetzij door een aan/uit-schakelaar aan te sluiten. Verwijder O1 en plaats de matglazen uitlijnkooi terug. Gebruik een kinematische spiegelbevestiging en een neerklapbare spiegel om de uitlijnstraal uit te lijnen met het pad van de excitatiestraal. Gebruik de vermogensmeter om het signaal van de uitlijnstraal na het gaatje te maximaliseren door de twee spiegels fijn af te stellen. Zorg ervoor dat de straal gecentreerd blijft op de matglazen uitlijnkooi. Verwijder de uitlijnkooi en plaats O1 terug. Plaats de vierkante spiegel op de monstertafel van O1 en pas de spiegel axiaal aan totdat de grootte van het straalprofiel na de dichroïsche is geminimaliseerd. Monteer één iris in het emissiepad en ver genoeg naar achteren zodat Scan Lens 2 (SL2), Tube Lens 2 (TL2) en Objective 2 (O2) zonder interferentie kunnen worden ingebracht. Lijn deze iris uit met de uitlijnlaser. Monteer een matglazen schijf minimaal 1 inch achter de iris en zorg ervoor dat deze ook is uitgelijnd met het laserlicht. Plaats SL2 op de juiste afstand, gemeten vanaf de galvo met een liniaal. Pas de kanteling en zijwaartse positie van SL2 zo aan dat de inkomende uitlijningsstraal gecentreerd is op SL2 en de uitgaande straal door de iris en de matglazen schijf gaat. Plaats TL2 op de juiste afstand, gemeten vanaf SL2 met een liniaal. Pas de kanteling en zijwaartse positie van TL2 zo aan dat de inkomende uitlijningsstraal gecentreerd is op TL2 en de uitgaande straal door de iris en matglazen schijf gaat. Monteer de TS2 op de tafel. Zorg ervoor dat de werktafel zich vertaalt langs de optische as van O2. Schroef O2 op een xy-vertaalbevestiging. Sluit een paal aan onder de xy-vatting om O2 op de vertaaltafel te monteren. Gebruik een schroefdoel om de achterkant van O2 op de rode laser te centreren. Pas de xy-knoppen en kanteling van O2 aan zodat de rode uitlijnstraal door de iris en de matglazen schijf gaat. Beweeg de uitlijnlaser tot boven O1 en naar beneden gericht in het emissiepad. Schakel de laser in en zorg ervoor dat deze straal gecentreerd is op alle lenzen in het emissiepad. Vervoeg de pupilvlakken van O1 en O2 door de iris te openen en de matglazen schijf te verwijderen, zodat de uitlijningsstraal die O2 verlaat ongehinderd doorloopt naar een verafgelegen oppervlak of muur (>0,5 m) (Figuur 4). Pas TS2 aan totdat de straal een kleine Airy-schijf op het oppervlak vormt en ga dan verder met het aanpassen van TS2 om de grootte van de Airy-schijf te minimaliseren.OPMERKING: Een sterk divergerende straal geeft de onjuiste plaatsing van O2 aan. Omdat deze straal echter door twee doelstellingen gaat, is een kleine mate van divergentie inherent. Als zodanig is de Airy-schijf de beste gids. Optimaliseer de galvo voor tilt-invariant scannen: Druk op de FSK-knop op de golfvormgenerator om een driehoeksgolfsignaal voor de galvo te selecteren en stel deze in op een lage frequentie (~1 Hz). Observeer de uitlijningsstraal op hetzelfde verre oppervlak of dezelfde muur.NOTITIE: Als de galvo verkeerd is geplaatst, zal de straal samen met de galvobeweging horizontaal over het oppervlak vegen. Dit kan worden opgelost door fijne aanpassingen (met de hand) van de kanteling en xy-positie van de galvobasis totdat de straalverplaatsing niet met het oog waarneembaar is. Controleer de kwaliteit van het systeem door beeldvorming bij 0°.Schroef O3 in een xy-translatiehouder. Schroef een 1 in lensbuis in de translatietrap van de kooi en schroef de xy-translatietrap in de buis. Gebruik twee kooistangen om de voorkant van de kooitranslatietafel te verbinden met een kooiplaat en monteer de kooiplaat op een paal. Monteer objectief 3 (O3) dicht bij de voorkant van O2 (~4-5 mm) op 0° en pas de hoogte daarop aan. Monteer een matglazen uitlijnschijf in het gedeelde brandpuntsvlak tussen SL2 en TL2, zoals gemeten met een liniaal. Monteer het acryl fluorescerende testglaasje op het object, en verlicht het glaasje met de excitatielaser. Kijk door de achterkant van O3, pas zowel de hoogte als de axiale positie van O3 aan om het emissielicht te vinden en pas vervolgens O3 axiaal aan totdat het emissielicht de achterste opening vult (Figuur 5). Schroef twee 8-in-kooistangen in de achterkant van de O3-translatietrap. Schuif een kooiplaat met een gemonteerde matglazen schijf op de staven en stel vervolgens de O3 fijn af met behulp van de xy-houder om ervoor te zorgen dat het emissielicht de O3 gecentreerd verlaat. Verwijder vervolgens de kooistangen. Monteer een matglazen schijf in de ruwe positie van de camerasensor en lijn de hoogte en positie van de schijf uit met het emissielicht. Schroef Tube Lens 3 (TL3) in een kooiplaat en monteer deze direct achter O3. Centreer TL3 op het inkomende emissielicht en pas vervolgens de kanteling van TL3 aan om het uitgaande licht uit te lijnen met de matglazen schijf. Monteer de camera op de juiste afstand van de buislens, gemeten met een liniaal. Schroef zowel de 2 in lensbuizen als het emissiefilter op de camera. Monteer de matglazen uitlijnschijf opnieuw in het gedeelde brandpuntsvlak tussen SL2 en TL2. Monteer het fluorescerende kleurstoftestmonster en verlicht het monster met de excitatiestraal. Schakel de camera in en open vervolgens het programma Micromanager op de aangesloten computer. Klik op Live om live view te openen. Klik eenmaal op Auto om de initiële belichtingsinstellingen in te stellen en stel vervolgens de belichting indien nodig opnieuw in bij het maken van de beeldvorming.OPMERKING: Micromanager werkt niet goed tenzij het wordt geopend nadat de camera is ingeschakeld. Pas de xy-translatieknoppen op de O3-vatting aan totdat het kleine gaatje in de glazen uitlijnschijf gecentreerd is binnen het gezichtsveld (FoV). Pas O3 axiaal aan met de translatietrap van de kooi totdat het gat scherp is; de randen moeten scherp lijken (Figuur 6). Afbeelding fluorescerende kralen om de kwaliteit van het systeem te controleren. Verwijder de matglazen uitlijnschijf, monteer het 3D-parelmonster en verlicht het monster met de excitatiestraal. Pas de hoogte van het monster ten opzichte van O1 aan totdat de fluorescerende kralen een cirkelvormig gebied in het midden van de FoV vullen. Pas de positie van O3 nauwkeurig aan met behulp van de xy-trap en de axiale translatietrap totdat de puntspreidingsfuncties (PSF’s) rond zijn (indicatief voor minimale aberraties) en helder (indicatief voor een goede signaal-ruisverhouding) (Figuur 7). Als dit niet kan worden bereikt door O3 aan te passen, is het zeer waarschijnlijk dat het optische systeem tussen de componenten O1 en O2 niet optimaal is uitgelijnd; Volg de diagnostische controles in stap 3.13 hieronder. Als er ronde PSF’s kunnen worden verkregen, slaat u de diagnostische stap over en gaat u verder met het kantelen van het beeldvormingssysteem. Voer indien nodig diagnostische controles uit.OPMERKING: Zodra goede PSF’s zijn verkregen, kunnen de rest van de diagnostische stappen worden overgeslagen.Monteer de helderveldlamp (BF) boven O1. Monteer het positieve rastertestdoel op de monstertafel op dezelfde axiale hoogte als de uitlijnspiegel. Centreer het raster van 10 μm en verlicht het raster met het BF-licht. Stel het raster op de camera vast en vertaal het voorbeeld totdat het raster scherp is. Gebruik de rasterafbeelding om te bevestigen dat het veld over de FoV vlak is: als dit niet het geval is, ziet het raster er vervormd en gebogen uit. Om een slecht rasterbeeld te corrigeren, past u de xyz-positie en kanteling van O3 aan en past u vervolgens de TL3 en de camera dienovereenkomstig aan.OPMERKING: Als een vlak raster kan worden bereikt, herhaalt u stap 3.12.10 en gaat u verder met het kantelen van het beeldvormingssysteem. Stel de uitlijncamera of de beeldcamera op de juiste afstand in, zodat SL2 het beeld op de sensor scherpstelt. Stel het rasterdoel in het tussenliggende vlak voor (Figuur 8). Als dit raster ook scheef is, is het zeer waarschijnlijk dat het optische systeem tussen de componenten O1 en SL2 suboptimaal is uitgelijnd en opnieuw moet worden bekeken. Optimaliseer de uitlijning indien nodig voordat u verder gaat.OPMERKING: Als de camera niet tussen SL2 en TL2 past, gebruik dan een extra spiegel om het beeld 90° na SL2 en op de camera te laten weerkaatsen. Controleer de PSF’s op het tussenvlak: Na het controleren van het raster is een andere goede diagnostische controle het controleren van de PSF’s op hetzelfde tussenvlak. Een goed beeld op dit vlak, dat vergelijkbaar is met figuur 7 maar bij een andere vergroting (figuur 9), duidt op een goede uitlijning door SL2.OPMERKING: Als een vlak raster en ronde PSF’s kunnen worden bereikt op het tussenvlak, herhaalt u stap 3.13.2 en vervolgens stap 3.12.10 en gaat u verder met het kantelen van het beeldvormingssysteem. Kantel het O3-beeldvormingssubsysteem tot 30°.Verwijder O3, TL3 en de camera. Plaats O3 terug in een hoek van 30° ten opzichte van de optische as van O2 met behulp van de lijnen op de tafel als richtlijn. Monteer een matglazen uitlijnschijf in het gedeelde brandpuntsvlak tussen SL2 en TL2. Monteer het acryl fluorescerende testglaasje op het object, en verlicht het glaasje met de excitatielaser. Kijk nogmaals door de achterkant van O3, pas zowel de hoogte als de axiale positie van O3 aan om het emissielicht op 30° te vinden, en pas vervolgens O3 axiaal aan totdat het emissielicht de achterste opening vult. Verwijder de matglazen uitlijnschijf tussen SL2 en TL2 om een sterker emissiesignaal te verkrijgen. Schroef twee 8-in-kooistangen in de achterkant van de O3-translatietrap. Schuif een kooiplaat met een gemonteerde matglazen schijf op de staven en stel vervolgens de O3 fijn af met behulp van de xy-houder om ervoor te zorgen dat het emissielicht de O3 gecentreerd verlaat. Verwijder vervolgens de kooistangen. Monteer een matglazen schijf in de ruwe positie van de camerasensor en lijn de hoogte en positie van de schijf uit met het emissielicht. Monteer TL3 direct achter O3. Centreer TL3 op het inkomende emissielicht en pas vervolgens de kanteling van TL3 aan om het uitgaande licht uit te lijnen met de matglazen schijf. Om de afstand tussen de TL3-camera nauwkeuriger in te stellen, schroeft u de O3 voorzichtig los en monteert u de uitlijnlaser zodat deze door TL3 op de camera wordt scherpgesteld. Gebruik indien nodig ND-filters, zodat de laserintensiteit <1 mW is. Start de liveweergave van de camera en pas de TL3 axiaal aan om de laservlek op de camera te minimaliseren. Monteer de matglazen uitlijnschijf opnieuw in het gedeelde brandpuntsvlak tussen SL2 en TL2. Monteer het fluorescerende kleurstoftestmonster en verlicht het monster met de excitatiestraal. Pas de xy-vertaalknoppen op de O3-vatting aan totdat het kleine gaatje in de glasuitlijnschijf zich binnen de FoV op de camera bevindt. Pas de translatiefase van de kooi aan om O3 axiaal te bewegen totdat het gat scherp is; Zorg ervoor dat het gat er bij 0° hetzelfde uitziet als bij 0°. Monteer het positieve rastertestdoel opnieuw op dezelfde axiale hoogte en verlicht het rooster met het BF-lampje. Controleer of er slechts één verticaal gedeelte is scherpgesteld (vanwege de kanteling van 30°). Nogmaals, gebruik de rasterafbeelding om te bevestigen dat het veld over de FoV vlak is, zelfs als het onscherp is. Wanneer de dia axiaal wordt vertaald, controleert u of het scherpgestelde gedeelte van de FoV (rasterdoel) horizontaal over het scherm veegt, terwijl de rastervierkanten een consistente grootte behouden (Afbeelding 10).OPMERKING: Door de kanteling van het beeldvormingsvlak bij het monster kan het raster enigszins uitgerekt lijken in het x-vlak. Figuur 4: Laser-in-laser-out techniek. Een gecollimeerde teststraal door de voorkant van O1 sturen en de straal observeren die O2 op een ver weg oppervlak verlaat. Als alle componenten op de juiste afstand zijn uitgelijnd, vormt de straal een kleine luchtige schijf op het verre oppervlak. Alle afkortingen zijn hetzelfde als in figuur 3. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 5: Emissielicht gebruiken voor uitlijning. (A) Emissielicht van een acryl fluorescerende dia op een schroefdoel achter de BFP van O2. (B) Het vinden van het emissielicht door middel van zicht door de achterkant van O3. Afkortingen: O2-O3 = doelstellingen; BFP = achterste brandpuntsvlak. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Afbeelding 6: Beeld op de camera van de correct gefocuste matglasuitlijnschijf. De schijf werd op het tussenvlak tussen SL2 en TL2 geplaatst. Schaalbalk = 50 μm. Afkortingen: SL2 = scanlens; TL2 = buis lens. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 7: Camerabeeld van het 3D-kralenmonster. De afbeelding toont kralen van 1 nm met de beeldvormingsmodule ingesteld op 0° en verlicht door een cirkelvormige straal voorafgaand aan het inbrengen van de cilindrische lenzen. Schaalbalk = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 8: Positief doel van de rastertest correct scherpgesteld op het tussenvlak tussen SL2 en TL2. De vlakke rasters over het hele veld duiden op een goede uitlijning van de componenten SL2 en eerder. Schaalbalk = 30 μm. Afkortingen: SL2 = scanlens; TL2 = buis lens. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 9: Camerabeeld van het 3D-kralenmonster. De afbeelding toont kralen van 1 nm die correct zijn scherpgesteld op het tussenvlak tussen SL2 en TL2. Schaalbalk = 30 μm. Afkortingen: SL2 = scanlens; TL2 = buis lens. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 10: Positief doel van de rastertest met een geel vierkant van consistente grootte dat overeenkomt met de vierkanten van het raster. (A) Raster in focus aan de linkerkant. (B) Raster in focus aan de rechterkant. Het gele vierkant komt overeen met de grootte van de rastervakken aan beide zijden van de FoV. Schaalbalken = 30 μm. Afkorting = FoV = gezichtsveld. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. 4. Uitlijnen van de schuine lichtplaat Verwijder O1 en plaats de dubbele matglazen uitlijnkooi terug op zijn plaats. Controleer of de straal gecollimeerd en gecentreerd is op beide matglazen schijven. Schroef cilindrische lens 1 (CL1) in een roterende lensvatting. Monteer CL1 in het optische pad en draai de houder zodat de straal wordt uitgezet in de richting verticaal ten opzichte van de optische tafel. Pas de kantel- en zijpositie van CL1 zo aan dat de balk gecentreerd is op de voorkant en een gecentreerde positie behoudt op beide matglazen schijven. Schroef cilindrische lens 2 (CL2) in een roterende lensvatting en monteer CL2 op de juiste afstand in het optische pad om een 4f-systeem met CL1 te vormen. Draai CL2 in dezelfde richting als CL1, zodat de straal in de richting verticaal op de optische tafel wordt uitgerekt en gecollimeerd. Gebruik een testkaart om de hoogte van het cilindrische balkprofiel op meerdere locaties te meten om er zeker van te zijn dat de balk wordt gecollimeerd. Pas de kantel- en zijwaartse positie van CL2 aan, zoals uitgevoerd in stap 4.2. Schroef cilindrische lens 3 (CL3) in een roterende lensvatting en monteer CL3 op de juiste afstand in het optische pad om een 4f-systeem met L3 te vormen. Draai CL3 in dezelfde richting als zowel CL1 als CL2, zodat de straal naar beneden wordt gericht op een horizontaal plaatprofiel in het brandpuntsvlak. Pas de kantel- en zijwaartse positie van CL3 aan, zoals uitgevoerd in stap 4.2. Plaats de spleet: Monteer de gleuf met behulp van vier 4 in kooistangen en de CL3-kooibevestiging in een verticale richting op het brandpuntsvlak tussen CL3 en L3, zoals gemeten met een liniaal. Gebruik het uitgerekte excitatiestraalprofiel om de hoogte en zijdelingse positie van de spleet aan te passen totdat deze gecentreerd is op de balk. Plaats O1 terug, monteer het fluorescerende kleurstoftestmonster en verlicht het monster met het excitatielichtblad. Controleer bij de camerasensor of de lichtplaat van 0° wordt weergegeven als een dunne verticale plaat (Figuur 11A). Verwijder het testmonster van de fluorescerende kleurstof en veeg O1 schoon. Laat de lichtkap ongehinderd boven O1 uitzetten. Gebruik de gemotoriseerde translatiefaseregeling om M1 in de richting van de cilindrische lenzen te vertalen om de hoek van de lichtplaat in te stellen op ongeveer 60° ten opzichte van de optische as van O1.NOTITIE: Het is van cruciaal belang dat de lichtplaat in de juiste richting wordt gekanteld om uit te lijnen met het eveneens gekantelde beeldvlak (Figuur 12); Als een systeem anders is ingedeeld dan dit specifieke ontwerp, kan de juiste richting van de kanteling worden achterhaald door middel van geometrische ray tracing.NOTITIE: Ter referentie, door M1 2.647 mm naar de gleuf te vertalen, wordt de lichtplaat in deze opstelling op de juiste helling gezet. Plaats het fluorescerende kleurstoftestmonster terug om het gekantelde vel af te beelden. Zorg ervoor dat de lichtplaat een verticale straalvorm op de camera heeft behouden, maar breder en zwakker is (Figuur 11B). Vertaal het monster axiaal met de objecttafel zodat de fluorescerende kleurstof wordt verlicht door de lichtplaat op vijf verschillende dieptes tussen het midden van de FoV en de rechterkant van het scherm. Sla elke afbeelding op. Open de afbeeldingen in Fiji. Selecteer voor elke afbeelding het gereedschap Lijn en trek een horizontale lijn van het midden van de FoV naar het midden van het lichtvel. Als u de verplaatsing wilt meten, gaat u naar Analyseren | Meet om de lengte van de lijnen te zien. Teken vervolgens de verplaatsing van de lichtplaat als functie van de monsterdiepte om de hoek van de lichtplaat boven O1 te berekenen. Vertaal M1 een beetje. Herhaal stap 4.9 en stap 4.10 totdat de hoek van de lichtplaat 60° is ten opzichte van de optische as van O1, overeenkomend met de hoek van het beeldvlak. Figuur 11: Camerabeelden van het testmonster voor fluorescerende kleurstoffen, verlicht door een correct gevormde lichtplaat. (A) de plaat onder een hoek van 90°, recht omhoog langs de optische as van O1, en (B) gekanteld tot 30° (60° ten opzichte van de optische as van O1). Schaalbalken = 50 μm. Afkorting: O1 = objectief. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Afbeelding 12: Corrigeer de richting van de kanteling van de lichtplaat om uit te lijnen met het beeldvlak van O1. Afkorting: O1-O3 = doelstellingen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. 5. Finetunen van het systeem voor beeldvorming en gegevensverzameling Monteer de 3D-kralendia en vertaal het monster axiaal met de objecttafel totdat de kralen de FoV op de camera vullen. Pas O3 aan met behulp van de xy-trap en de kooitranslatiefase, met als doel aberraties te minimaliseren en de signaal-ruisverhouding in het beeld te optimaliseren (Figuur 13). Pas de correctiekraag van O1 aan, met als doel aberraties te minimaliseren en de signaal-ruisverhouding in het beeld te optimaliseren. Figuur 13: Camerabeelden van het 3D-parelmonster (korrels van 1 μm) verlicht door een correct gevormde lichtplaat. (A) Plaat in een hoek van 90°, recht omhoog langs de optische as van O1, en (B) 30° gekanteld ten opzichte van de optische as van O1. Het gele vak geeft het deel van de FoV aan dat vlak, consistent en bruikbaar is (80 μm x 80 μm) en waarin betrouwbare gegevens kunnen worden vastgelegd. Schaalbalken = 50 μm. Afkortingen: O1 = objectief; FoV = gezichtsveld. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. 6. De vergroting van het systeem kalibreren Monteer het positieve rastertestdoel op de monstertafel en verlicht met het helderveldlicht. Vertaal de rasterdia axiaal met de werktafel om de rasterdia scherp te stellen. Breng het midden van het raster in beeld. Leg de afbeelding vast, sla deze op en open deze vervolgens in Fiji. Gebruik het gereedschap Lijn en de functie Meten in Fiji om de afstand tussen twee rasterlijnen nauwkeurig in pixels te meten. Deel deze waarde door de bekende afstand (10 μm) om de pixel-naar-micron-kalibratie te bepalen. Bereken de vergroting (M) van het systeem met behulp van de gemeten grootte van de pixel en de bekende grootte van een pixel met vergelijking (1).(1) 7. Volumetrische scans verkrijgen Plaats het monster.Schakel het cameravoorbeeld, de galvo, de functiegenerator, de voeding, het podium en de excitatielaser in. Monteer het monster en klik vervolgens op de FSK-knop op de functiegenerator om een driehoeksgolf in te stellen. Om het voorbeeld te vinden, gebruikt u de functiegenerator om het volgende in te stellen: 400 mV piek-tot-piekamplitude (met behulp van de Ampl. -knop), 0 offset (met behulp van de Offset-knop ) en 200 mHz-frequentie. Gebruik het Micromanager-venster om een belichtingstijd van 100 ms in te stellen. Scroll handmatig in z totdat het voorbeeldvlak is bereikt. Optimaliseer de z-instelling zodat het gewenste gebied voor de volumetrische scan gedurende één cyclus door het scherm gaat. Selecteer de scanparameters.Zorg ervoor dat de piek-tot-piekamplitude correct is ingesteld door visueel te controleren of het voorbeeld tijdens de scan scherp lijkt te zijn. Als de beeldkwaliteit eerder verslechtert bij het naderen van het ene uiteinde van de scan dan bij het andere, bewerkt u de verschuiving op de functiegenerator om het midden van de scan naar het betere gebied te verplaatsen. Selecteer in het programma Micromanager een belichtingstijd en klik op Multi-D Acq. om het venster Multidimensionale acquisitie te openen. Gebruik het vak Aantal om het aantal frames te kiezen, waarmee de totale acquisitietijd wordt ingesteld. Het interval tussen frames (framesnelheid) wordt ingesteld door de belichtingstijd, tenzij een langer interval is opgegeven in het vak Interval. Stel op de functiegenerator de frequentie in om een volledige volumescan te maken met de helft van de periode van de driehoeksgolffunctie (lineaire scan in één richting).OPMERKING: Als de framesnelheid en -frequentie te laag zijn, worden er te weinig frames verkregen voor een volumescan en zorgt het lage framenummer voor zichtbare artefacten in de nabewerking. Ter referentie: Figuur 13 was samengesteld uit ~100 frames in de scan en Figuur 14 was samengesteld uit ~800. Het is ook van cruciaal belang om bij het selecteren van de parameters rekening te houden met het monster zelf. Zorg ervoor dat de belichtingstijd zo is ingesteld dat het monster voldoende geëxciteerd maar niet verzadigd is. Hiertoe kan ook de intensiteit van de excitatielaser worden aangepast. Als de gebruiker een reeks volumetrische scans aanschaft om een in de tijd variërend proces in 3D te karakteriseren, zorg er dan voor dat de scantijdschaal de tijdschaaldynamiek van het systeem overschrijdt. Video’s verzamelen: Schaf een time-lapse aan die ten minste de duur van een volledige op- of afrit van de driehoeksgolf vastlegt, wat overeenkomt met één volledige scan van het volume. 8. Procedures voor nabewerking Deskewing volumetrische beeldstapelsZet de volumescans rechtop om de stapel afbeeldingen in gekantelde vlakken om te zetten in een reeks afbeeldingen in echte xyz-coördinaten.OPMERKING: Er bestaan veel uitstekende handleidingen voor de nabewerking van light-sheet-afbeeldingen en open-sourcesoftware om het rechtzetten van bestaande volumescans uit te voeren, evenals om rechtewingen uit te voeren en scheefgetrokken afbeeldingen op te slaan tijdens acquisitie24. Om de volumescans scheef te zetten, verkrijgt u de volgende twee parameters: de werkelijke afstand tussen twee frames in pixels (d), en de hoek tussen het framevlak en het x-y-vlak (θ wordt bepaald door de hoek van de schuine lichtplaat (in dit systeem 30°). De afstand tussen frames is afhankelijk van de beeldoptiek en de acquisitie-instellingen. De d-parameter vindenKalibreer de afstand tussen frames voor elke keer dat het systeem aanzienlijk opnieuw is uitgelijnd. Voer deze kalibratie uit met een stapel afbeeldingen van fluorescerende kralen, omdat deze het gemakkelijkst te gebruiken zijn voor het diagnosticeren van problemen. Verkrijg een stapel afbeeldingen en voer de deskewing-code uit met behulp van een eerste gok voor de d-parameter. Open de rechtgezette afbeeldingsstapel in ImageJ en blader door de stapel. Als d substantieel ver van de werkelijke waarde is ingesteld, merk dan op dat de kralen kunstmatig langwerpig in x of y verschijnen, en dat individuele kralen in het xy-vlak lijken te bewegen terwijl de gebruiker door de frames in z scrolt (in plaats van scherp te stellen en te vervagen vanaf hetzelfde centrale punt). Herhaal de d-parameter meerdere keren totdat deze problemen niet langer zichtbaar zijn. Zodra de d-parameter redelijk dicht bij de werkelijke waarde lijkt te liggen, berekent u projecties van de maximale intensiteit van de afbeeldingsstapel langs de x- en y-richtingen. Merk op dat kralen met een diameter in de buurt van de diffractielimiet langwerpig kunnen lijken in z, maar idealiter zouden ze niet conisch of diagonaal uitgerekt moeten lijken. Verfijn de deskewing-parameters totdat deze criteria niet substantieel verbeteren met nieuwe iteraties. Ter referentie: de gegevens in figuur 13 waren scheef op d = 2,50 pixels en de gegevens in figuur 14 op d = 1,0 pixels.OPMERKING: De afstand tussen frames is lineair afhankelijk van de scanamplitude, frequentie en framesnelheid.