細胞骨格ネットワークの可視化のためのカスタマイズ可能な単一対物レンズライトシート蛍光顕微鏡の設計と構築

1. アライメントの準備 ビルドを開始する前に、必要な文献レビューを実施して、意図するユースケース(イメージングする蛍光色素、必要なイメージングボリューム、解像度要件など)を明確に把握します。特に、以下の代表的な結果のセクションを参照して、ここで説明する正確な設計に従うことが適切かどうかを判断してください。その場合は、手順 1.2 に進みます。そうでない場合は、Sheunglab SOLS ビルド ガイド23 でハードウェア選択の提案とガイダンスを見つけてください。メモ:この特定のシステムの仕様の詳細については、ディスカッションの項を参照してください。 材料表に詳述されているように、必要な光学部品、光機械部品、および電気部品をすべて収集します。システムを変更するユーザーの場合は、同等の部品をすべて収集します。 図2Aに示すようにアライメントレーザーを構築します。せん断プレートを使用してビームがコリメートされていることを確認します。 図2Bに示すように、二重すりガラスディスク位置合わせケージを組み立てます。 蛍光染料でコーティングされた試験サンプルを準備します。1 mLの蒸留水を0.2 gの凍結乾燥粉末に徐々に加え、すべてが溶解するまで飽和ローダミン染料溶液を作成します。均質化するためのボルテックス。注意: このソリューションは光に敏感です。調製中に必要な予防措置はありませんが、調製後は必ず暗い場所に保管してください。注意: ローダミンパウダーを取り扱うときは、常に手袋とマスクを着用してください。 テストスライドの中央に10 μLをピペットで移動します。 22 mm x 22 mmのカバーガラスを液体の上に置き、蛍光の層ができるだけ薄くなるようにします。 透明なマニキュアで密封します。注意: このサンプルは光に敏感です。サンプルの寿命を最大限に延ばすには、使用しないときはスライドを暗い場所に保管してください。 3Dビーズサンプル(ゲルに埋め込まれた1μmビーズ)を調製します。両面テープを使用して、サンプルスライドに幅4〜5mmの垂直チャネルを作成し、テープを3層の高さにスライドさせます。 スライド中央のテープの上に22 mm x 22 mmのカバーガラスを置きます。テープで留めた部分をしっかりと押して、テープとカバーガラスがしっかりと密閉されるようにします。 かみそりの刃を使用して、余分なテープを取り除きます。 125mLの飽和ジェランガム粉末1gに脱イオン水を徐々に加えて調製する。この溶液は、室温では固体、65°Cでは液体になります。 1 mLのジェランガム溶液を微量遠心チューブに入れます。ホットプレートで水の入った容器を65°Cに加熱し、ジェランガムが目に見える粘性になるまで微量遠心チューブを温めます。 1:1,000に希釈したビーズ10 μLを温めたジェランガム溶液に調製します。 溶液をチャンバーに完全にピペットで移すまで慎重にピペットで固定します。つまようじを使用して、チャネルの両側に少量のエポキシを軽くたたき、開口部を完全に覆って密閉します。適切なシーリングを確実にするために、両端を目視検査して、エポキシがチャネルの両端にわずかに浸透していることを確認します。 図2:アライメントツールの写真。 (A)コリメートアライメントレーザー。AL1:アライメントレンズ1、-50mm;AL2:アライメントレンズ2、100mm(B)ダブルフロストガラスディスクアライメントケージ。略語:RMS CP = RMSねじ式ケージプレート。SM1 CP = SM1ネジ付きケージプレート。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。 2. 励起経路の整列 光学テーブルの表面に顕微鏡のレイアウトをスケッチします。すべての距離をできるだけ正確に測定します。メモ:システム内のコンポーネントの位置については、 図3 を参照してください。 励起レーザーをテーブルに取り付けます。2つの虹彩をレーザーの目的の高さに設定し、ミラー2(M3)の位置の後ろにある目的の穴のラインに1〜1フィート離して取り付けます。これらの虹彩を使用して、ビームがテーブル表面と同じ高さにあり、光学テーブルの穴の線の中心にあることを確認します。注意: 目の保護のためにレーザー保護メガネを着用し、安全上の予防措置としてレーザー安全スクリーンで迷走レーザー光線を遮断してください。すべてのコンポーネントが恒久的にクランプされるまで、数時間単位のドリフトが発生する可能性があります。一日の終わりにアライメントの最も遠いポイントにアイリスを設置し、ビルドに戻るときにドリフトをすばやく視覚的に確認します。振動、不適切に浮いた光学テーブル、および気流は、光学ドリフトの最も一般的な原因です。 レーザーシャッターを励起レーザーにできるだけ近づけて取り付けます。このシャッターを利用して、レーザーのオンとオフを繰り返すのではなく、位置合わせ中にレーザー光をすばやく遮断します。 NDフィルターをNDフィルターホイール(ND 0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、ブランクスロット)に組み立て、レーザーシャッターの後に取り付けます。 電動アクチュエーターを1つの並進ステージ(TS1)に切り替えてから、ステージをM1の位置の下に挿入します。ステージが、レーザー光がたどる穴と同じ線に沿って軸方向に移動することを確認します。初期配置の範囲の中央にステージを設定します。次の手順2.6-2.10では、反射光学部品を一度に1つずつビームパスに挿入して、テーブルに描かれたパスに沿ってレーザーを向けます。正確な高さに設定された虹彩のペアを使用して、目的の射出ビームパスを定義し、各反射要素の配置と位置合わせをガイドします。各要素について、マウントの高さと位置を調整して、入射ビームが中央に当たるようにします。次に、マウントのベースを回転させて、テーブル上に引き出されたビームパスに沿ってビームを向け、両方のアイリスを通過するようにし、各マウントの背面にあるノブで出射ビームの傾きを微調整します。注意: 各要素が正しい高さに揃ったら、支柱にスリッポンカラーを追加して高さを固定します。 M1をTS1の上に取り付けて位置合わせします。 ダイクロイックをテーブルに取り付けて位置合わせします。 製造元の指示に従って、ガルボを電源および関数発生器に接続します。 レーザーがミラーの正確な中心に入射するようにガルボを取り付けます。ガルバノの電源を入れ、波形発生器のAMボタンを押したままにして、ミラーの傾きを0VDC電流(範囲の中心)に設定します。次に、ガルボを虹彩に合わせます。 ミラー2(M2)を取り付けて位置合わせします。 大きな円筒形ミラーを円筒形ミラーマウントに挿入します。1インチのケージロッドを使用して、ミラー3(M3)の上に30〜60mmのケージアダプターを取り付けます。ミラーマウントのノブを使用して、初期配置のM3ミラーの傾きを平らにします。 二重曇りガラスアライメントケージをM3の上のケージアダプターに取り付けます。 位置合わせに使用するたびに、位置合わせケージを所定の位置に保持するケージアダプターの止めネジを必ず締めてください。M3をテーブルに取り付け、ビームが両方のすりガラスのアライメントディスクのほぼ中央に来るまで高さと位置を調整します。M3をテーブルにクランプし、M3の両側にポストマウント、3つのポスト、90°クランプ、2つのポストを使用して、ミラーマウントの両側にあるテープ穴を使用してサポートを追加します。ミラーの背面にあるノブを使用して、ビームを微調整します。注:励起経路のすべての反射要素が設定され、触れないでください。 レンズ1(L1)をテーブルに取り付けます。すべての初期レンズ配置では、ねじ込み式のレンズターゲットを使用して、入射ビームをレンズの前面の中央に配置します。レンズ1(L1)の傾きと横方向の位置を調整して、ビームがM3の上のアライメントケージの両方のすりガラス板の中心に来るようにします。 レンズ2(L2)をそれぞれの位置に取り付けて、L1で4fシステムを作成します。L2を軸方向に動かしてコリメートビームを取得し、励起レーザーとせん断板を使用してコリメーションを確認します。L2の傾きと横方向の位置を調整して、M3の上にある両方のすりガラスディスクのビームを中央に配置します。 ピンホールをxy並進マウントに取り付けます。これを1D並進ステージの上に取り付けて、細かい軸方向の並進を提供します。ピンホールとステージをポストとポストマウントに取り付け、L1とL2の間の共有フォーカルポイントに配置します。レーザー光がピンホールを通して見えるようになるまで、ピンホールを手で調整します。 ピンホールの直後にパワーメーターセンサーを取り付け、パワーメーターのデジタルコンソールにある波長ボタンを使用して励起レーザーの波長を選択します。ピンホールのxy位置を調整して透過率を最大化し、TEM00に近いビームプロファイルを取得します。次に、1Dステージでピンホールを軸方向に調整して、透過率をさらに最大化します。 レンズ4(L4)をテーブルの位置に取り付け、マウントを正しい高さに調整します。励起ビームがガルバノの表面に集中するようにL4を軸方向に調整します。L4 の傾きと横方向の位置を調整して、ビームを M3 の上の両方のすりガラス ディスクの中央に配置します。 レンズ3(L3)をテーブルの位置に取り付け、マウントを正しい高さに調整します。励起レーザーとせん断板を使用して、L3とL4のコリメーションを確認します。L3 の傾きと横方向の位置を調整して、M3 の上にある両方のすりガラス ディスクのビームを中央に配置します。 L3 を一時的に取り外します。スキャンレンズ1(SL1)をテーブルに取り付け、軸方向距離を調整して、せん断プレートで測定したL4のコリメート望遠鏡を形成します。SL1 の傾きと横方向の位置を調整して、M3 の上にある両方のすりガラス ディスクのビームを中央に配置します。 L3 を再挿入します。チューブレンズ1(TL1)を取り付け、励起ビームとせん断板を使用してSL1とTL1をコリメートします。TL1 の傾きと横方向の位置を調整して、ビームを M3 の上の両方のすりガラス ディスクの中央に配置します。 アダプターリングを使用して、対物レンズ1(O1)をM3の上のケージプレートにねじ込みます。SL1を一時的に取り外し、ビームを天井に当てます。ビームが天井にエアリーディスクを形成するまでケージシステムのO1の高さ(軸方向距離)を調整し、ディスクのサイズが最小になるまで調整を続けます。 O1を所定の位置に置き、サンプルステージを適切な位置に取り付けます。 図3:SOLSシステム内のコンポーネントの位置。 (A)すべてのコンポーネントにラベルを付けたSOLSシステムの概略レイアウト。(B)光学テーブル上の物理的なSOLSシステムのトップダウン写真(サンプルステージ領域を除く)。(C)サンプルステージ領域のトップダウン写真( 図3Bの延長)。励起経路は緑色で示されています。放出経路は赤で示されています。レンズの焦点距離:L1:100 mm;L2:45ミリメートル;CL1:50ミリメートル;CL2:200ミリメートル;CL3:100ミリメートル;長さ3:150ミリメートル;L4:100ミリメートル;SL1:75ミリメートル;TL1:200ミリメートル;SL2:150ミリメートル;TL2:125ミリメートル;TL3:200ミリメートル。より詳細な部品仕様については、 部品表 を参照してください。略語:SOLS = 単一目的ライトシート;NDホイール=可変減光フィルターホイール。L1-L4 =平凹アクロマートレンズ;CL1-CL3 =シリンドリカルレンズ;M1-M3 =ミラー;TS1-TS2 = 翻訳ステージ。DM = ダイクロイックミラー;ガルボ=走査型検流計;SL1-SL2 =スキャンレンズ;TL1-TL2 = チューブレンズ;O1-O3 =目的;EF = エミッションフィルター。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。 3. 放出経路の調整 アライメントレーザーをセットアップします。励起レーザーの横に、レーザーと同じ高さの空のケージプレートを2枚取り付けます。これらのケージプレートを使用して、アライメントレーザーのケージロッドを2つのケージプレートの空いている穴にスライドさせることにより、アライメントレーザーを取り付けます。電源ボタンの周りをテープで固定するか、オン/オフスイッチを配線して、レーザーをオンの位置に設定できることを確認します。 O1を取り外し、すりガラスの位置合わせケージを再度挿入します。1つのキネマティックミラーマウントと1つのドロップダウンミラーを使用して、アライメントビームを励起ビームパスに位置合わせします。 パワーメーターを使用して、2つのミラーを微調整することにより、ピンホール後のアライメントビームの信号を最大化します。梁がすりガラスの位置合わせケージの中心にあることを確認します。 位置合わせケージを取り外し、O1を再度挿入します。四角いミラーをO1のサンプルステージに置き、ダイクロイック後にビームプロファイルのサイズが最小になるまでミラーを軸方向に調整します。 スキャンレンズ2(SL2)、チューブレンズ2(TL2)、対物レンズ2(O2)を干渉なく挿入できるように、1つのアイリスを放射経路に十分に後方に取り付けます。この虹彩をアライメントレーザーに合わせます。虹彩の少なくとも1インチ後ろにすりガラスディスクを取り付け、これもレーザー光線に合わせます。 定規でガルボから測定した正しい距離でSL2を挿入します。入射アライメントビームがSL2の中心になり、出射ビームが虹彩とすりガラスディスクを通過するように、SL2の傾きと横方向の位置を調整します。 定規でSL2から測定した正しい距離でTL2を挿入します。入射アライメントビームがTL2の中心になり、出射ビームが虹彩とすりガラスディスクを通過するように、TL2の傾きと横方向の位置を調整します。 TS2をテーブルに取り付けます。ステージがO2の光軸に沿って移動することを確認します。 O2をxy変換マウントにねじ込みます。xyマウントの下に支柱を接続して、O2をトランスレーションステージにマウントします。ねじ込み式ターゲットを使用して、O2の背面を赤色レーザーの中央に配置します。 赤いアライメントビームが虹彩とすりガラスのディスクを通過するように、O2のxyノブと傾きを調整します。 アライメントレーザーをO1より上に移動し、放射経路に下向きに向けます。レーザーをオンにし、このビームが放射経路内のすべてのレンズの中心にあることを確認します。 虹彩を開き、すりガラスディスクを取り外して、O1とO2の瞳面を共役させ、O2から出るアライメントビームが遠くの表面または壁(>0.5 m)に遮られずに続くようにします(図4)。ビームが表面に小さなエアリーディスクを形成するまでTS2を調整し、次にエアリーディスクのサイズを最小化するためにTS2の調整を続けます。注意: ビームが強く発散している場合は、O2の配置が正しくないことを示しています。ただし、このビームは 2 つの対物レンズを通過するため、少量の発散が生じます。そのため、Airyディスクが最良のガイドです。 チルト不変スキャン用にガルバノを最適化する:波形発生器のFSKボタンを押してガルボの三角波信号を選択し、低周波(~1 Hz)に設定します。同じ遠くのサーフェスまたは壁上のアライメントビームを観察します。注意: ガルバノが正しく配置されていない場合、ビームはガルバノの動きとともに表面上を水平にスイープします。これは、ビームの変位が目視で検出できなくなるまで、ガルバノベースの傾きとxy位置を(手で)微調整することで解決できます。 0°でイメージングしてシステムの品質を確認します。O3をxy並進マウントにねじ込みます。1インチのレンズチューブをケージ並進ステージにねじ込み、xy並進ステージをチューブにねじ込みます。2本のケージロッドを使用して、ケージ並進ステージの前面をケージプレートに接続し、ケージプレートを支柱に取り付けます。 オブジェクティブ3(O3)をO2(~4~5mm)の前面に0°で取り付け、それに合わせて高さを調整します。 定規で測定したSL2とTL2の間の共有焦点面にすりガラスのアライメントディスクを取り付けます。アクリル蛍光テストスライドをステージに取り付け、励起レーザーでスライドを照らします。O3の背面を覗き込み、O3の高さと軸方向の位置の両方を調整して発光光を見つけ、発光光が背面の開口部を満たすまでO3を軸方向に調整します(図5)。 ケージロッド2本をO3トランスレーションステージの背面にねじ込みます。すりガラスディスクを取り付けたケージプレートをロッドにスライドさせ、xyマウントを使用してO3を微調整し、発光がO3の中心から出るようにします。次に、ケージロッドを取り外します。 カメラセンサーの大まかな位置にすりガラスディスクを取り付け、ディスクの高さと位置を発光に合わせます。 チューブレンズ3(TL3)をケージプレートにねじ込み、O3のすぐ後ろに取り付けます。TL3 を入射光の中心に置き、TL3 の傾きを調整して、出射光を曇りガラスディスクに合わせます。 定規で測定したチューブレンズからの正しい距離にカメラを取り付けます。 2つのレンズチューブとエミッションフィルターの両方をカメラにねじ込みます。 すりガラスアライメントディスクをSL2とTL2の間の共有焦点面に再取り付けします。蛍光色素試験サンプルを取り付け、励起ビームでサンプルを照らします。 カメラの電源を入れ、接続しているコンピューターでMicromanagerプログラムを開きます。 [ライブ ]をクリックしてライブビューに入ります。[ Auto Once ]をクリックして露出の初期設定を行い、必要に応じて露出をリセットして撮影します。メモ: Micromanagerは、カメラの電源を入れ た後に 開かないと正しく機能しません。 ガラスアライメントディスクの小さな穴が視野(FoV)の中央に来るまで、O3マウントのxy変換ノブを調整します。穴に焦点が合うまで、ケージ並進ステージでO3を軸方向に調整します。エッジがシャープに見えるはずです(図6)。 蛍光ビーズを画像化して、システムの品質を確認します。 すりガラスアライメントディスクを取り外し、3Dビーズサンプルを取り付けて、励起ビームでサンプルを照らします。 蛍光ビーズがFoVの中心にある円形の領域を満たすまで、O1を基準にしたサンプルの高さを調整します。 点像分布関数(PSF)が丸く(収差が最小であること)、明るく(S/N比が良好であることを示す)になるまで、xyステージと軸方向並進ステージを使用してO3の位置を微調整します(図7)。O3を調整してもこれが達成できない場合、コンポーネントO1とO2の間の光学系が最適に整列していない可能性が高くなります。以下の手順 3.13 の診断チェックに従います。 丸いPSFが得られた場合は、診断ステップをスキップして、イメージングシステムの傾きに進みます。 必要に応じて診断チェックを実行します。メモ: 正常な PSF を取得したら、残りの診断手順を省略できます。明視野(BF)ライトをO1の上に取り付けます。ポジティブグリッドテストターゲットをサンプルステージの アライメントミラーと同じ軸方向の高さに取り付けます。10μmのグリッドを中央に配置し、BFライトでグリッドを照らします。 カメラでグリッドをイメージし、グリッドに焦点が合うまでサンプルを平行移動します。グリッド画像を使用して、FoV全体のフィールドが平坦であることを確認します:そうでない場合は、グリッドが歪んで曲がって表示されます。悪いグリッド画像を修正するには、O3のxyz位置と傾きを調整してから、それに応じてTL3とカメラを調整します。メモ:平坦なグリッドを実現できる場合は、手順3.12.10を繰り返してから、イメージングシステムの傾きに進みます。 SL2がセンサーに画像の焦点を合わせるように、アライメントカメラまたはイメージングカメラを正しい距離に設定します。中間平面のグリッドターゲットを画像化します(図 8)。このグリッドも歪んでいる場合は、コンポーネントO1とSL2の間の光学系が最適ではない位置合わせになっている可能性が高く、再検討する必要があります。続行する前に、必要に応じてアライメントを最適化します。注意: カメラがSL2とTL2の間に収まらない場合は、追加のミラーを使用して、SL2の90°後にカメラに画像をバウンスさせます。 中間プレーンの PSF の検査: グリッドを検査した後、同じ中間プレーンの PSF を検査するのも、適切な診断検査です。この平面の良好な画像は、 図7 と似ていますが、倍率が異なり(図9)、SL2を介して良好なアライメントを示しています。メモ:中間平面で平坦なグリッドと丸いPSFを実現できる場合は、手順3.13.2を繰り返し、次に手順3.12.10を繰り返してから、イメージングシステムの傾きに進みます。 O3イメージングサブシステムを30°に傾けます。O3、TL3、およびカメラを取り外します。 テーブルの線をガイドとして使用して、O3の光軸に対して2°でO2を再挿入します。 SL2とTL2の間の共有焦点面にすりガラスのアライメントディスクを取り付けます。アクリル蛍光テストスライドをステージに取り付け、励起レーザーでスライドを照らします。もう一度、O3の背面を覗き、O3の高さと軸方向の位置の両方を調整して30°の発光を見つけ、発光光が背面の開口部を満たすまでO3を軸方向に調整します。 SL2 と TL2 の間からすりガラスのアライメント ディスクを取り外して、より強い放射信号を取得します。 ケージロッド2本をO3トランスレーションステージの背面にねじ込みます。すりガラスディスクを取り付けたケージプレートをロッドにスライドさせ、xyマウントを使用してO3を微調整し、発光がO3の中心から出るようにします。次に、ケージロッドを取り外します。 カメラセンサーの大まかな位置にすりガラスディスクを取り付け、ディスクの高さと位置を発光に合わせます。 O3のすぐ後ろにTL3をマウントします。TL3 を入射光の中心に置き、TL3 の傾きを調整して、出射光を曇りガラスディスクに合わせます。 TL3カメラの距離をより正確に設定するには、O3を慎重に緩め、TL3によってカメラに焦点を合わせるようにアライメントレーザーを取り付けます。必要に応じてNDフィルターを使用して、レーザー強度が<1mWになるようにします。カメラの ライブビューを開始し、TL3を軸方向に調整して、カメラのレーザースポットを最小限に抑えます。 すりガラスアライメントディスクをSL2とTL2の間の共有焦点面に再取り付けします。蛍光色素試験サンプルを取り付け、励起ビームでサンプルを照らします。ガラスアライメントディスクの小さな穴がカメラのFoV内に収まるまで、O3マウントのxy変換ノブを調整します。ケージの並進ステージを調整して、穴に焦点が合うまでO3を軸方向に動かします。穴が0°の場合と同じように表示されることを確認します。 正のグリッドテストターゲットを同じ軸方向の高さに再取り付けし、BFライトでグリッドを照らします。垂直セクションが 1 つだけ焦点が合っていることを確認します (30 度の傾きのため)。もう一度、グリッド画像を使用して、焦点が合っていない場合でも、FoV全体のフィールドが平坦であることを確認します。スライドを軸方向に移動するときに、FoV(グリッドターゲット)の焦点の合っている部分が画面を水平方向にスイープし、グリッドの正方形が一定のサイズを維持していることを確認します(図10)。注:サンプルのイメージング面が傾いているため、グリッドがx面でわずかに引き伸ばされて見える場合があります。 図4:レーザーインレーザーアウト技術。 O1の前面にコリメートされたテストビームを送信し、O2から出るビームを遠くの表面で観察します。すべてのコンポーネントが正しい距離で整列している場合、ビームは遠くの表面に小さなエアリーディスクを形成します。すべての省略形は 図 3 と同じです。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。 図5:アライメントに発光光を利用する様子。 (A)O2のBFPの後ろのねじ込み式ターゲット上のアクリル蛍光スライドからの発光光。(B)O3の背面から目視で発光光を見つける。略語:O2-O3 =目的;BFP = バックフォーカルプレーン。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。 図6:正しく焦点を合わせたすりガラスアライメントディスクのオンカメラ画像。 ディスクはSL2とTL2の中間平面に配置されました。スケールバー = 50 μm。略語:SL2 =スキャンレンズ;TL2 = チューブレンズ。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。 図7:3Dビーズサンプルのカメラ画像。 この画像は、シリンドリカルレンズを挿入する前に、イメージングモジュールを0°に設定し、円形ビームで照らした1nmビーズを示しています。スケールバー = 50 μm。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。 図8:SL2とTL2の中間面に正しく焦点を合わせたポジティブグリッドテストターゲット。 フィールド全体にわたる平坦なグリッドは、コンポーネントSL2以前が良好に位置合わせされていることを示しています。スケールバー = 30 μm。略語:SL2 =スキャンレンズ;TL2 = チューブレンズ。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。 図9:3Dビーズサンプルのカメラ画像。 この画像は、SL2 と TL2 の中間面に正しく焦点を合わせた 1 nm ビーズを示しています。スケールバー = 30 μm。略語:SL2 =スキャンレンズ;TL2 = チューブレンズ。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。 図10:グリッドの正方形と一致するように、一定のサイズの黄色の正方形が重ねられた正のグリッドテストターゲット。 (A)左側に焦点が合っているグリッド。(B)右側に焦点が合っているグリッド。黄色の四角形は、FoV の両側にあるグリッド ボックスのサイズと一致します。スケールバー = 30 μm。 略語 = FoV = 視野。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。 4. 斜めのライトシートの位置合わせ O1を取り外し、二重すりガラスの位置合わせケージをその場所に再度挿入します。ビームがコリメートされ、両方のすりガラスディスクの中央に配置されていることを確認します。 シリンドリカルレンズ1(CL1)を回転レンズマウントにねじ込みます。CL1を光路にマウントし、ビームが光学テーブルに対して垂直な方向に拡大するようにマウントを回転させます。CL1の傾きと横方向の位置を調整して、ビームが前面の中央に配置され、両方のすりガラスディスクの中心位置が維持されるようにします。 シリンドリカルレンズ2(CL2)を回転レンズマウントにねじ込み、CL2を正しい距離で光路に取り付けて、CL4で1fシステムを形成します。CL2をCL1と同じ向きに回転させ、ビームが光学テーブルに対して垂直な方向に引き伸ばされ、コリメートされるようにします。テストカードを使用して、複数の場所で円筒形のビームプロファイルの高さを測定し、ビームがコリメートされていることを確認します。手順2で行ったように、CL4.2の傾きと横方向の位置を調整します。 シリンドリカルレンズ3(CL3)を回転レンズマウントにねじ込み、CL3を正しい距離で光路に取り付けて、L3で4fシステムを形成します。CL3 を CL1 と CL2 の両方と同じ方向に回転させ、ビームが焦点面の水平シート プロファイルに集束するようにします。手順3で実行したように、CL4.2の傾きと横方向の位置を調整します。 スリットを挿入する:4つの4インチケージロッドとCL3ケージマウントを使用して、定規で測定したCL3とL3の間の焦点面にスリットを垂直方向に取り付けます。引き伸ばされた励起ビームプロファイルを使用して、スリットの高さと横方向の位置を、ビームの中心になるまで調整します。 O1を再挿入し、蛍光色素試験サンプルをマウントし、励起ライトシートでサンプルを照らします。カメラセンサーで、0°のライトシートが薄い垂直シートとして表示されることを確認します(図11A)。 蛍光染料試験サンプルを取り出し、O1をきれいに拭き取ります。ライトシートを遮るものなくO1の上に広げます。電動並進ステージ制御を使用して、M1をシリンドリカルレンズ に向かって 平行移動させ、ライトシートの角度をO1の光軸に対して約60°に設定します。注:ライトシートを正しい方向に傾けて、同様に傾いた撮像面に合わせることが重要です(図12)。システムがこの特定の設計と異なるレイアウトになっている場合、幾何学的なレイトレーシングによって傾きの正しい方向を割り出すことができます。注意: 参考までに、M1 2.647 mmをスリットに向かって移動させると、このセットアップではライトシートが正しい傾きに設定されます。 蛍光染料テストサンプルを再挿入して、傾いたシートを画像化します。ライトシートがカメラ上で垂直ビーム形状を維持しているが、幅が広く、暗くなっていることを確認します(図11B)。 サンプルをステージと軸方向に並進させ、FoVの中心と画面の右側の間の5つの異なる深さで蛍光色素がライトシートによって照らされるようにします。各画像を保存します。 フィジーで画像を開きます。画像ごとに、 線ツールを選択し、FoV の中心からライトシートの中心まで水平線を引きます。変位を測定するには、[ 解析] |線 の長さを確認するために測定します。次に、ライトシートの変位をサンプル深度の関数としてプロットし、O1より上のライトシートの角度を計算します。 M1 を少し移動します。ステップ4.9とステップ4.10を繰り返して、ライトシートの角度がO1の光軸から60°になり、結像面の角度が一致します。 図11:正しい形状のライトシートで照らされた蛍光色素試験サンプルのカメラ画像。 (A)シートをO1の光軸に沿って90°にまっすぐ上に、(B)30°(O1の光軸に対して60°)に傾けた。スケールバー = 50 μm。 略語: O1 = 対物レンズ。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。 図12:ライトシートの傾きの正しい方向をO1の撮像面に合わせます。 略語:O1-O3 =目的。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。 5. イメージングとデータ収集のためのシステムの微調整 3Dビーズスライドを取り付け、ビーズがカメラのFoVを満たすまで、サンプルをステージで軸方向に移動します。 xyステージとケージ並進ステージを使用してO3を調整し、収差を最小限に抑え、画像のS/N比を最適化することを目指します(図13)。 O1の補正環を調整し、収差を最小限に抑え、画像のS/N比を最適化することを目指します。 図13:正しい形状のライトシートで照らされた3Dビーズサンプル(1μmビーズ)のカメラ画像。 (A)O1の光軸に沿って90°のシート、(B)O1の光軸に対して30°に傾けたシート。黄色のボックスは、平坦で一貫性があり、使用可能なFoVの部分(80 μm x 80 μm)を示しており、信頼性の高いデータを取得できる部分を示しています。スケールバー = 50 μm。 略語: O1 = 対物レンズ;FoV = 視野。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。 6.システムの倍率の校正 ポジティブグリッドテストターゲットをサンプルステージに取り付け、明視野ライトで照らします。 グリッドスライドをステージに合わせて軸方向に移動して、グリッドスライドに焦点を合わせます。グリッドの中心に焦点を合わせます。 画像をキャプチャして保存し、フィジーで開きます。 フィジーの [線] ツール と [計測] 関数 を使用して、2 本のグリッド線間の距離をピクセル単位で正確に計測します。この値を既知の距離(10 μm)で割って、ピクセルからミクロンへのキャリブレーションを決定します。 測定されたピクセルのサイズと、式 (1) のピクセルの既知のサイズを使用して、システムの倍率 (M) を計算します。(1) 7. ボリュメトリックスキャンの取得 サンプルを配置します。カメラのプレビュー、ガルボ、関数発生器、電源、ステージ、励起レーザーをオンにします。 サンプルをマウントし、関数発生器の FSK ボタンをクリックして三角波を設定します。サンプルを見つけるには、関数発生器を使用して、 400 mV のピーク to ピーク振幅 ( [Ampl. ] ボタンを使用)、 0 オフセット ( [Offset ] ボタンを使用)、および 200 mHz の周波数を設定します。 Micromanager ウィンドウ を使用して、 100 ms の露光時間を設定します。 サンプル平面に達するまで、手動でzをスクロールします。ボリュームスキャンに必要な領域が1サイクルの間に画面を通過するように z設定 を最適化します。 スキャンパラメータを選択します。スキャン中にプレビューに焦点が合っているように見えることを視覚的に確認して、ピークtoピークの振幅が正しく設定されていることを確認します。スキャンの一方の端に近づくともう一方の端よりも早く画質が低下する場合は、関数発生器のオフセットを編集して、スキャンの中心をより良い領域に移動します。 Micromanager プログラムで露光時間を選択し、Multi-D Acq. をクリックして Multi-Dimensional Acquisition ウィンドウを開きます。[カウント]ボックスを使用してフレーム数を選択し、合計取得時間を設定します。フレーム間の間隔(フレームレート)は、[間隔]ボックスでより長い間隔が指定されていない限り、露出時間によって設定されます。関数発生器で、三角波関数の周期の1/2でフルボリュームスキャンを作成する周波数を設定します(一方向の線形スキャン)。注:フレームレートと周波数が低すぎると、ボリュームスキャンで取得されるフレームが少なすぎて、フレーム数が少ないと、後処理で目に見えるアーティファクトが作成されます。参考までに、 図 13 はスキャンの ~100 フレーム で構成され、 図 14 は ~800 フレームで構成されています。また、パラメータを選択する際には、サンプル自体を考慮することも重要です。露光時間は、サンプルが十分に励起され、飽和しないように設定してください。励起レーザーの強度もこの目的のために調整することができます。ユーザーが一連の体積スキャンを取得して、時間とともに変化するプロセスを3Dで特徴付ける場合は、スキャンのタイムスケールがシステムのタイムスケールダイナミクスを超えていることを確認してください。 ビデオの収集:少なくとも三角波のフルランプアップまたはランプダウンの持続時間(ボリュームの1回のフルスキャンに対応する)をキャプチャするタイムラプスを取得します。 8. 後処理手順 ボリュメトリック画像スタックの傾き補正ボリュームスキャンの傾き補正を行い、傾斜した平面の画像のスタックを実際のxyz座標の一連の画像に変換します。注:ライトシート画像の後処理や、既存のボリュームスキャンの傾き補正を実行したり、画像取得中に傾き補正を行ったり、傾き補正された画像を保存したりするためのオープンソースソフトウェアに関する優れたガイドが多数存在します24。 ボリュームスキャンの傾き補正を行うには、2つのフレーム間の実際の距離(ピクセル単位)と、フレーム平面とx-y平面の間の角度(θは斜めのライトシートの角度(このシステムでは 30°)で設定)の2つのパラメータを取得します。フレーム間の距離は、イメージング光学系と取得設定によって異なります。 d パラメーターの検索システムが大幅に再調整されるたびに、フレーム間の距離を調整します。このキャリブレーションは、問題の診断に最も使いやすい蛍光ビーズの画像のスタックで実行してください。 イメージのスタックを取得し、 d パラメーターの初期推定を使用してデスキュー コードを実行します。傾き補正されたイメージ スタックを ImageJ で開き、スタックをスクロールします。 d が真の値からかなり離れて設定されている場合は、ビーズが x または y で人為的に引き伸ばされて見え、ユーザーが z のフレームをスクロールすると、個々のビーズが xy 平面上を移動するように見えることに注意してください (同じ中心点から焦点を合わせたり焦点ぼけたりするのではなく)。これらの問題が明らかでなくなるまで、 d パラメーターを複数回繰り返します。 d パラメーターが真の値に適度に近づいたら、x 方向と y 方向に沿ったイメージ スタックの最大強度投影を計算します。回折限界に近い直径のビーズは、z方向に細長く見えることがありますが、理想的には円錐形に見えたり、斜めに細長くなったりしてはいけません。これらの基準が新しい反復で大幅に改善されなくなるまで、傾き補正パラメータを微調整します。参考までに、図 13 のデータは d = 2.50 ピクセルで、図 14 のデータは d = 1.0 ピクセルで傾き補正されています。注:フレーム間の距離は、スキャンの振幅、周波数、およびフレームレートに直線的に依存します。