Design und Bau eines anpassbaren, einobjektiven Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskops zur Visualisierung von Zytoskelettnetzwerken

1. Vorbereitung für die Ausrichtung Führen Sie vor Beginn des Builds alle erforderlichen Literaturrecherchen durch, um eine klare Vorstellung vom beabsichtigten Anwendungsfall zu erhalten (z. B. die abzubildenden Fluorophore, das erforderliche Bildgebungsvolumen, die Auflösungsanforderungen). Beziehen Sie sich insbesondere auf den Abschnitt “Repräsentative Ergebnisse” unten, um zu entscheiden, ob es angemessen ist, das hier beschriebene genaue Design zu befolgen. Wenn dies der Fall ist, fahren Sie mit Schritt 1.2 fort. Wenn nicht, finden Sie Vorschläge und Anleitungen zur Hardwareauswahl im Sheunglab SOLS Build Guide23.HINWEIS: Der Benutzer kann weitere Informationen zu den Spezifikationen dieses speziellen Systems im Diskussionsbereich finden. Sammeln Sie alle erforderlichen optischen, optomechanischen und elektrischen Komponenten, wie in der Materialtabelle beschrieben. Für Benutzer, die das System modifizieren, sammeln Sie alle gleichwertigen Teile. Bauen Sie den Ausrichtungslaser wie in Abbildung 2A dargestellt. Prüfen Sie, ob der Balken mit der Schubplatte kollimiert ist. Bauen Sie den doppelten Scheibenausrichtungskäfig aus Milchglas, wie in Abbildung 2B dargestellt. Bereiten Sie die mit fluoreszierendem Farbstoff beschichtete Testprobe vor.Stellen Sie eine gesättigte Rhodamin-Farbstofflösung her, indem Sie nach und nach 1 ml destilliertes Wasser zu 0,2 g gefriergetrocknetem Pulver hinzufügen, bis sich alles aufgelöst hat. Vortex zum Homogenisieren.HINWEIS: Diese Lösung ist lichtempfindlich. Obwohl bei der Zubereitung keine Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden müssen, stellen Sie sicher, dass die Lösung nach der Zubereitung an einem dunklen Ort gelagert wird.ACHTUNG: Tragen Sie beim Umgang mit Rhodaminpulver immer Handschuhe und eine Maske. Pipettieren Sie 10 μl in die Mitte eines Testobjektträgers. Legen Sie ein 22 mm x 22 mm großes Deckglas auf die Flüssigkeit und achten Sie darauf, dass die Fluoreszenzschicht so dünn wie möglich ist. Mit klarem Nagellack versiegeln.HINWEIS: Dieses Muster ist lichtempfindlich. Um die Lebensdauer der Probe zu maximieren, stellen Sie sicher, dass der Objektträger an einem dunklen Ort gelagert wird, wenn er nicht verwendet wird. Bereiten Sie die 3D-Beads vor (1 μm Kügelchen eingebettet in Gel).Verwenden Sie doppelseitiges Klebeband, um einen 4-5 mm breiten vertikalen Kanal auf einem Objektträger zu erzeugen, der drei Lagen Klebeband hoch ist. Legen Sie ein 22 mm x 22 mm großes Deckglas auf das Klebeband in der Mitte des Objektträgers. Drücken Sie fest auf die abgeklebten Bereiche, um eine gute Abdichtung zwischen Klebeband und Deckglas zu gewährleisten. Verwenden Sie eine Rasierklinge, um das überschüssige Klebeband zu entfernen. Bereiten Sie 125 ml gesättigte Gellangummilösung vor, indem Sie nach und nach DI-Wasser zu 1 g Gellangummipulver geben. Diese Lösung ist bei Raumtemperatur fest und bei 65 °C flüssig. Geben Sie 1 ml Gellangummilösung in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Erhitzen Sie einen Behälter mit Wasser auf einer heißen Platte bei 65 °C und erwärmen Sie das Mikrozentrifugenröhrchen, bis das Gellangummi sichtbar viskos ist. Bereiten Sie 10 μl einer 1:1.000-Verdünnung von Kügelchen in erwärmter Gellangummilösung vor. Pipettieren Sie die Lösung vorsichtig in die Kammer, bis sie voll ist. Tupfen Sie mit einem Zahnstocher eine kleine Menge Epoxidharz auf beide Seiten des Kanals und bedecken Sie die Öffnungen vollständig, um sie abzudichten. Um eine ordnungsgemäße Abdichtung zu gewährleisten, überprüfen Sie beide Enden visuell, um sicherzustellen, dass das Epoxidharz jedes Ende des Kanals leicht durchdrungen hat. Abbildung 2: Fotos der Ausrichtungswerkzeuge. (A) Kollimierter Ausrichtungslaser. AL1: Ausrichtungslinse 1, −50 mm; AL2: Ausrichtungslinse 2, 100 mm (B) Doppelter Scheibenausrichtungskäfig aus Milchglas. Abkürzungen: RMS CP = RMS-Gewindekäfigplatte; SM1 CP = SM1 Käfigplatte mit Gewinde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. 2. Ausrichten des Anregungspfades Skizzieren Sie das Mikroskoplayout auf der Oberfläche des optischen Tisches. Messen Sie alle Entfernungen so genau wie möglich.HINWEIS: In Abbildung 3 finden Sie die Position der Komponenten im System. Montieren Sie den Anregungslaser auf dem Tisch. Stellen Sie zwei Iris auf die vorgesehene Höhe des Lasers ein und montieren Sie sie im Abstand von 2-3 Fuß an der gewünschten Lochlinie hinter der Position von Spiegel 1 (M1). Verwenden Sie diese Iris, um sicherzustellen, dass der Strahl auf gleicher Höhe mit der Tischoberfläche und zentriert auf der Lochlinie auf dem optischen Tisch ist.HINWEIS: Tragen Sie zum Schutz der Augen eine Laserschutzbrille und blockieren Sie als Sicherheitsvorkehrung alle verstreuten Laserstrahlen mit Laserschutzschirmen. Bis alle Komponenten dauerhaft festgeklemmt sind, ist eine Drift in der Größenordnung von Stunden möglich. Richten Sie am Ende eines jeden Tages eine Iris am weitesten entfernten Punkt der Ausrichtung ein, um sie bei der Rückkehr zum Build schnell auf Drift zu überprüfen. Vibrationen, ein falsch schwebender optischer Tisch und Luftströmungen sind die häufigsten Ursachen für optische Drift. Montieren Sie den Lasershutter so nah wie möglich am Anregungslaser. Verwenden Sie diesen Verschluss, um das Laserlicht während der Ausrichtung schnell zu blockieren, anstatt den Laser wiederholt ein- und auszuschalten. Montieren Sie die ND-Filter in das ND-Filterrad (ND 0,5, 1,0, 2,0, 3,0, 4,0 und einen leeren Steckplatz) und montieren Sie sie nach dem Laserverschluss. Schalten Sie den motorisierten Aktuator auf einen Verschiebetisch (TS1) und setzen Sie den Tisch dann unter die Position von M1 ein. Stellen Sie sicher, dass der Tisch axial entlang derselben Lochlinie verschoben wird, der das Laserlicht folgt. Stellen Sie die Bühne in der Mitte des Bereichs für die Erstplatzierung ein.In den folgenden Schritten 2.6-2.10 werden die reflektierenden optischen Komponenten nacheinander in den Strahlengang eingesetzt, um den Laser entlang der auf dem Tisch gezeichneten Bahn zu richten. Verwenden Sie das auf die exakte Höhe eingestellte Irispaar, um den gewünschten Austrittsstrahlengang zu definieren und die Platzierung und Ausrichtung jedes reflektierenden Elements zu steuern. Passen Sie für jedes Element die Höhe und Position der Halterung an, um sicherzustellen, dass der einfallende Strahl die Mitte trifft. Drehen Sie dann die Basis der Montierung, um den Strahl entlang des langgezogenen Strahlengangs auf dem Tisch so zu lenken, dass er durch beide Iris geht, und stellen Sie die Neigung des ausgehenden Strahls mit den Knöpfen auf der Rückseite jeder Montierung fein ein.HINWEIS: Nachdem jedes Element auf die richtige Höhe ausgerichtet ist, fügen Sie dem Pfosten einen Aufsteckkragen hinzu, um die Höhe zu sichern. Montieren und richten Sie M1 auf TS1 aus. Montieren und richten Sie den dichroitischen auf dem Tisch aus. Schließen Sie den Galvo gemäß den Anweisungen des Herstellers an die Stromversorgung und den Funktionsgenerator an. Montieren Sie den Galvo so, dass der Laser genau auf die Mitte des Spiegels fällt. Schalten Sie den Galvo ein und halten Sie dann die AM-Taste am Wellenformgenerator gedrückt, um die Spiegelneigung auf 0 V Gleichstrom (Mitte des Bereichs) einzustellen. Richten Sie nun den Galvo an der Iris aus. Montieren und richten Sie Mirror 2 (M2) aus. Setzen Sie den großen zylindrischen Spiegel in die zylindrische Spiegelhalterung ein. Verwenden Sie 1-Zoll-Käfigstangen, um einen 30-60-mm-Käfigadapter über Spiegel 3 (M3) zu befestigen. Verwenden Sie die Knöpfe an der Spiegelhalterung, um die Neigung des M3-Spiegels für die anfängliche Platzierung zu verringern. Montieren Sie den doppelt mattierten Glasausrichtungskäfig in den Käfigadapter über M3. Achten Sie darauf, die Stellschrauben am Käfigadapter anzuziehen, mit denen der Ausrichtungskäfig jedes Mal an Ort und Stelle gehalten wird, wenn er zum Ausrichten verwendet wird. Montieren Sie M3 am Tisch und passen Sie die Höhe und Position an, bis der Strahl ungefähr auf beiden Milchglas-Ausrichtungsscheiben zentriert ist. Klemmen Sie M3 an den Tisch und verwenden Sie eine Pfostenhalterung, 3 in Pfosten, 90°-Klemme und 2 Pfosten auf beiden Seiten von M3, um mit den abgeklebten Löchern auf beiden Seiten der Spiegelhalterung Unterstützung hinzuzufügen. Verwenden Sie die Knöpfe auf der Rückseite des Spiegels, um den Strahl fein einzustellen.HINWEIS: Alle reflektierenden Elemente im Anregungspfad sind jetzt eingestellt und sollten nicht berührt werden. Montieren Sie Objektiv 1 (L1) auf dem Tisch. Verwenden Sie für alle anfänglichen Linsenplatzierungen ein aufschraubbares Linsenziel, um den einfallenden Strahl auf der Vorderseite des Objektivs zu zentrieren. Passen Sie die Neigung und die seitliche Position von Linse 1 (L1) an, bis der Strahl auf beiden Milchglasplatten auf dem Ausrichtungskäfig über M3 zentriert ist. Montieren Sie Objektiv 2 (L2) in seiner jeweiligen Position, um ein 4f-System mit L1 zu erstellen. Bewegen Sie L2 axial, um einen kollimierten Strahl zu erhalten, und verwenden Sie den Anregungslaser und die Scherplatte, um die Kollimation zu überprüfen. Stellen Sie die Neigung und die seitliche Position von L2 ein, um den Strahl auf beiden Milchglasscheiben über M3 zu zentrieren. Montieren Sie die Lochblende in eine xy-Translationshalterung. Montieren Sie dies auf einem 1D-Verschiebungstisch, um eine feine axiale Verschiebung zu erzielen. Montieren Sie die Lochblende und den Tisch an einem Pfosten und einer Pfostenhalterung und platzieren Sie sie am gemeinsamen Brennpunkt zwischen L1 und L2. Stellen Sie die Lochblende von Hand ein, bis das Laserlicht durch die Lochblende zu sehen ist. Montieren Sie den Leistungsmessersensor unmittelbar nach der Lochblende und wählen Sie mit der Wellenlängentaste auf der Digitalkonsole des Leistungsmessers die Wellenlänge des Anregungslasers aus. Passen Sie die xy-Position der Lochblende an, um die Transmission zu maximieren und ein Trägerprofil nahe TEM00 zu erhalten. Stellen Sie dann die Lochblende axial mit dem 1D-Tisch ein, um die Übertragung weiter zu maximieren. Montieren Sie Objektiv 4 (L4) in seiner Position auf dem Tisch und stellen Sie die Halterung auf die richtige Höhe ein. Stellen Sie L4 axial so ein, dass der Anregungsstrahl auf die Oberfläche des Galvos fokussiert ist. Stellen Sie die Neigung und die seitliche Position von L4 ein, um den Strahl auf beiden Milchglasscheiben über M3 zu zentrieren. Montieren Sie Objektiv 3 (L3) in seiner Position auf dem Tisch und stellen Sie die Halterung auf die richtige Höhe ein. Verwenden Sie den Anregungslaser und die Scherplatte, um die Kollimation von L3 und L4 zu überprüfen. Stellen Sie die Neigung und die seitliche Position von L3 ein, um den Strahl auf beiden Milchglasscheiben über M3 zu zentrieren. L3 vorübergehend entfernen. Montieren Sie die Scanlinse 1 (SL1) auf dem Tisch und stellen Sie den Achsabstand so ein, dass ein kollimiertes Teleskop mit L4 entsteht, wie mit der Scherplatte gemessen. Passen Sie die Neigung und die seitliche Position von SL1 an, um den Strahl auf beiden Milchglasscheiben über M3 zu zentrieren. L3 wieder einsetzen. Montieren Sie die Tubuslinse 1 (TL1) und verwenden Sie den Anregungsstrahl und die Scherplatte, um SL1 und TL1 zu kollimieren. Passen Sie die Neigung und seitliche Position von TL1 an, um den Strahl auf beiden Milchglasscheiben über M3 zu zentrieren. Objektiv 1 (O1) mit einem Adapterring in die Käfigplatte über M3 einschrauben. Entfernen Sie SL1 vorübergehend und lassen Sie den Balken auf die Decke treffen. Stellen Sie die Höhe (axialer Abstand) von O1 am Käfigsystem ein, bis der Balken eine luftige Scheibe an der Decke bildet, und stellen Sie sie dann weiter ein, bis die Größe der Scheibe minimiert ist. Montieren Sie den Probentisch mit O1 in der entsprechenden Position. Abbildung 3: Position der Komponenten innerhalb des SOLS-Systems. (A) Schematischer Aufbau des SOLS-Systems mit allen beschrifteten Komponenten. (B) Top-Down-Foto des physischen SOLS-Systems auf dem optischen Tisch, ohne den Probentischbereich. (C) Top-Down-Foto des Probentischbereichs (Erweiterung zu Abbildung 3B). Der Anregungspfad ist grün dargestellt. Der Emissionspfad ist rot dargestellt. Brennweiten der Objektive: L1: 100 mm; L2: 45 mm; CL1: 50 mm; CL2: 200 mm; CL3: 100 mm; L3:150 mm; L4: 100 mm; SL1: 75 mm; TL1: 200 mm; SL2: 150 mm; TL2: 125 mm; TL3: 200 mm. In der Materialtabelle finden Sie detailliertere Teilespezifikationen. Abkürzungen: SOLS = Single-Objective Light-Sheet; ND Wheel = Filterrad mit variabler Neutraldichte; L1-L4 = plankonkave achromatische Linsen; CL1-CL3 = zylindrische Linsen; M1-M3 = Spiegel; TS1-TS2 = Translationsstufen; DM = dichroitischer Spiegel; Galvo = scannendes Galvanometer; SL1-SL2 = Scan-Objektive; TL1-TL2 = Tubuslinsen; O1-O3 = Ziele; EF = Emissionsfilter. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. 3. Ausrichtung des Emissionspfads Richten Sie den Ausrichtungslaser ein.Montieren Sie zwei leere Käfigplatten neben dem Anregungslaser auf Höhe des Lasers. Verwenden Sie diese Käfigplatten, um den Ausrichtungslaser zu montieren, indem Sie die Käfigstangen des Ausrichtungslasers in die leeren Löcher in den beiden Käfigplatten schieben. Stellen Sie sicher, dass der Laser in die Ein-Position gebracht werden kann, indem Sie entweder den Netzschalter umkleben oder einen Ein-/Ausschalter verdrahten. Entfernen Sie O1 und setzen Sie den Milchglas-Ausrichtungskäfig wieder ein. Verwenden Sie eine kinematische Spiegelhalterung und einen Klappspiegel, um den Ausrichtungsstrahl auf den Anregungsstrahlengang auszurichten. Verwenden Sie den Leistungsmesser, um das Signal des Ausrichtungsstrahls nach der Lochblende zu maximieren, indem Sie die beiden Spiegel fein justieren. Stellen Sie sicher, dass der Strahl auf dem Milchglas-Ausrichtungskäfig zentriert bleibt. Entfernen Sie den Ausrichtungskäfig und setzen Sie O1 wieder ein. Platzieren Sie den quadratischen Spiegel auf dem Probentisch von O1 und stellen Sie den Spiegel axial ein, bis die Größe des Strahlprofils nach dem dichroitischen Strahl minimiert ist. Montieren Sie eine Blende im Emissionspfad und weit genug nach hinten, damit Scanlinse 2 (SL2), Tubuslinse 2 (TL2) und Objektiv 2 (O2) störungsfrei eingesetzt werden können. Richten Sie diese Iris am Ausrichtungslaser aus. Montieren Sie eine Milchglasscheibe mindestens 1 Zoll hinter der Iris und stellen Sie sicher, dass diese auch auf das Laserlicht ausgerichtet ist. Setzen Sie SL2 im richtigen Abstand ein, gemessen vom Galvo mit einem Lineal. Passen Sie die Neigung und die seitliche Position von SL2 so an, dass der einfallende Ausrichtungsstrahl auf SL2 zentriert ist und der ausgehende Strahl durch die Iris und die Milchglasscheibe geht. Führen Sie TL2 im richtigen Abstand ein, gemessen von SL2 mit einem Lineal. Passen Sie die Neigung und die seitliche Position von TL2 so an, dass der einfallende Ausrichtungsstrahl auf TL2 zentriert ist und der ausgehende Strahl durch die Iris und die Milchglasscheibe verläuft. Montieren Sie TS2 auf dem Tisch. Stellen Sie sicher, dass der Tisch entlang der optischen Achse von O2 verschoben wird. Schrauben Sie O2 auf eine xy-Translationshalterung. Schließen Sie einen Pfosten unter der xy-Halterung an, um O2 auf dem Translationstisch zu montieren. Verwenden Sie ein anschraubbares Ziel, um die Rückseite von O2 auf dem roten Laser zu zentrieren. Stellen Sie die xy-Knöpfe und die Neigung von O2 so ein, dass der rote Ausrichtungsstrahl durch die Iris und die Milchglasscheibe geht. Bewegen Sie den Ausrichtungslaser über O1 und richten Sie ihn nach unten in den Emissionspfad. Schalten Sie den Laser ein und stellen Sie sicher, dass dieser Strahl auf alle Linsen im Emissionspfad zentriert ist. Konjugieren Sie die Pupillenebenen von O1 und O2 , indem Sie die Iris öffnen und die Milchglasscheibe entfernen, so dass der aus O2 austretende Ausrichtungsstrahl ungehindert zu einer weit entfernten Oberfläche oder Wand (>0,5 m) weitergeht (Abbildung 4). Stellen Sie TS2 ein, bis der Strahl eine kleine Airy-Scheibe auf der Oberfläche bildet, und stellen Sie dann TS2 weiter ein, um die Größe der Airy-Scheibe zu minimieren.HINWEIS: Ein stark divergierender Strahl zeigt die falsche Platzierung von O2 an. Da dieser Strahl jedoch zwei Ziele durchläuft, ist eine geringe Divergenz inhärent. Daher ist die Airy-Scheibe der beste Leitfaden. Optimieren Sie den Galvo für neigungsinvariantes Scannen: Drücken Sie die FSK-Taste am Wellenformgenerator, um ein Dreieckswellensignal für den Galvo auszuwählen, und stellen Sie ihn auf eine niedrige Frequenz (~1 Hz) ein. Beobachten Sie den Ausrichtungsbalken auf derselben weit entfernten Oberfläche oder Wand.HINWEIS: Wenn der Galvo falsch platziert ist, streicht der Strahl zusammen mit der Galvobewegung horizontal auf der Oberfläche. Dies kann durch Feineinstellungen (von Hand) der Neigung und xy-Position der Galvobasis behoben werden, bis die Strahlverschiebung mit dem Auge nicht mehr erkennbar ist. Überprüfen Sie die Qualität des Systems, indem Sie bei 0° abbilden.Schrauben Sie O3 in eine xy-Translationshalterung. Schrauben Sie einen 1-Zoll-Linsentubus in den Käfigverschiebetisch und den xy-Translationstisch in den Tubus. Verwenden Sie zwei Käfigstangen, um die Vorderseite des Käfigverschiebetisches mit einer Käfigplatte zu verbinden, und montieren Sie die Käfigplatte an einem Pfosten. Montieren Sie Objektiv 3 (O3) nahe der Vorderseite von O2 (~4-5 mm) bei 0° und passen Sie die Höhe entsprechend an. Montieren Sie eine Milchglas-Ausrichtungsscheibe in der gemeinsamen Brennebene zwischen SL2 und TL2, gemessen mit einem Lineal. Montieren Sie den fluoreszierenden Acryl-Testobjektträger auf dem Tisch und beleuchten Sie den Objektträger mit dem Anregungslaser. Schauen Sie durch die Rückseite von O3, stellen Sie sowohl die Höhe als auch die axiale Position von O3 ein, um das Emissionslicht zu finden, und stellen Sie dann O3 axial ein, bis das Emissionslicht die hintere Öffnung ausfüllt (Abbildung 5). Schrauben Sie zwei 8-Zoll-Käfigstangen in die Rückseite des O3-Translationstisches. Schieben Sie eine Käfigplatte mit einer montierten Milchglasscheibe auf die Stäbe und stellen Sie dann O3 mit der xy-Halterung fein ein, um sicherzustellen, dass das Emissionslicht zentriert aus O3 austritt. Entfernen Sie dann die Käfigstangen. Montieren Sie eine Milchglasscheibe in der groben Position des Kamerasensors und richten Sie die Höhe und Position der Scheibe am Emissionslicht aus. Schrauben Sie die Tubuslinse 3 (TL3) in eine Käfigplatte und montieren Sie sie unmittelbar hinter O3. Zentrieren Sie TL3 auf das einfallende Emissionslicht und passen Sie dann die Neigung von TL3 an, um das austretende Licht an der Milchglasscheibe auszurichten. Montieren Sie die Kamera im richtigen Abstand zum Tubusobjektiv, gemessen mit einem Lineal. Schrauben Sie sowohl 2-Zoll-Objektivtuben als auch den Emissionsfilter auf die Kamera. Montieren Sie die Milchglas-Ausrichtungsscheibe wieder in der gemeinsamen Brennebene zwischen SL2 und TL2. Montieren Sie die Fluoreszenzfarbstoff-Testprobe und beleuchten Sie die Probe mit dem Anregungsstrahl. Schalten Sie die Kamera ein und öffnen Sie dann das Micromanager-Programm auf dem angeschlossenen Computer. Klicken Sie auf Live , um die Live-Ansicht aufzurufen. Klicken Sie auf Auto Once , um die anfänglichen Belichtungseinstellungen festzulegen, und setzen Sie die Belichtung dann bei Bedarf beim Fotografieren zurück.HINWEIS: Micromanager funktioniert nicht richtig, es sei denn, er wird nach dem Einschalten der Kamera geöffnet. Stellen Sie die xy-Verschiebungsknöpfe an der O3-Halterung ein, bis das kleine Loch in der Glasausrichtungsscheibe im Sichtfeld (FoV) zentriert ist. O3 axial mit dem Käfigverschiebetisch einstellen, bis das Loch scharf ist; die Kanten sollten scharf erscheinen (Abbildung 6). Bilden Sie fluoreszierende Kügelchen ab, um die Qualität des Systems zu überprüfen. Entfernen Sie die Milchglas-Ausrichtungsscheibe, montieren Sie die 3D-Perlenprobe und beleuchten Sie die Probe mit dem Anregungsstrahl. Passen Sie die Höhe der Probe relativ zu O1 an, bis die fluoreszierenden Kügelchen einen kreisförmigen Bereich in der Mitte des Sichtfelds ausfüllen. Stellen Sie die Position von O3 mit dem xy-Tisch und dem axialen Translationstisch fein ein, bis die Punktspreizfunktionen (PSFs) rund (auf minimale Aberrationen) und hell (auf ein gutes Signal-Rausch-Verhältnis) (Abbildung 7) sind. Wenn dies nicht durch Einstellen von O3 erreicht werden kann, ist es sehr wahrscheinlich, dass das optische System zwischen den Komponenten O1 und O2 suboptimal ausgerichtet ist; Befolgen Sie die Diagnoseprüfungen in Schritt 3.13 unten. Wenn runde PSFs erhalten werden können, überspringen Sie den Diagnoseschritt und fahren Sie mit dem Kippen des Bildgebungssystems fort. Führen Sie bei Bedarf Diagnoseprüfungen durch.HINWEIS: Sobald gute PSFs erhalten wurden, können die restlichen Diagnoseschritte übersprungen werden.Montieren Sie das Hellfeld (BF) über O1. Montieren Sie das positive Gittertesttarget auf dem Probentisch in der gleichen axialen Höhe wie der Ausrichtungsspiegel. Zentrieren Sie das 10-μm-Gitter und beleuchten Sie das Gitter mit dem BF-Licht. Stellen Sie das Raster auf der Kamera dar und verschieben Sie das Beispiel, bis das Raster scharf ist. Verwenden Sie das Rasterbild, um zu bestätigen, dass das Feld über dem Sichtfeld flach ist: Wenn nicht, erscheint das Raster verzerrt und gebogen. Um ein schlechtes Rasterbild zu korrigieren, passen Sie die xyz-Position und -neigung von O3 an und passen Sie dann den TL3 und die Kamera entsprechend an.HINWEIS: Wenn ein flaches Raster erreicht werden kann, wiederholen Sie Schritt 3.12.10 und fahren Sie dann mit dem Neigen des Bildgebungssystems fort. Stellen Sie die Ausrichtungskamera oder die Bildkamera im richtigen Abstand auf, damit SL2 das Bild auf den Sensor fokussiert. Bilden Sie das Gitterziel auf der Zwischenebene ab (Abbildung 8). Wenn dieses Gitter ebenfalls verzerrt ist, ist es sehr wahrscheinlich, dass das optische System zwischen den Komponenten O1 und SL2 suboptimal ausgerichtet ist und überarbeitet werden sollte. Optimieren Sie die Ausrichtung nach Bedarf, bevor Sie fortfahren.HINWEIS: Wenn die Kamera nicht zwischen SL2 und TL2 passt, verwenden Sie einen zusätzlichen Spiegel, um das Bild um 90° nach SL2 auf die Kamera zu spiegeln. Überprüfen Sie die PSFs auf der Zwischenebene: Nach der Überprüfung des Rasters besteht eine weitere gute Diagnoseprüfung darin, die PSFs auf derselben Zwischenebene zu überprüfen. Ein gutes Bild in dieser Ebene, das Abbildung 7 ähnelt, aber eine andere Vergrößerung aufweist (Abbildung 9), zeigt eine gute Ausrichtung durch SL2 an.HINWEIS: Wenn ein flaches Raster und runde PSFs auf der Zwischenebene erreicht werden können, wiederholen Sie die Schritte 3.13.2, dann 3.12.10 und fahren Sie dann mit dem Neigen des Bildgebungssystems fort. Neigen Sie das O3-Bildgebungssubsystem um 30°.Entfernen Sie O3, TL3 und die Kamera. Setzen Sie O3 in einem Winkel von 30° zur optischen Achse von O2 wieder ein, wobei Sie sich an den Linien auf dem Tisch orientieren. Montieren Sie eine Milchglas-Ausrichtungsscheibe in der gemeinsamen Brennebene zwischen SL2 und TL2. Montieren Sie den fluoreszierenden Acryl-Testobjektträger auf dem Tisch und beleuchten Sie den Objektträger mit dem Anregungslaser. Schauen Sie noch einmal durch die Rückseite von O3, stellen Sie sowohl die Höhe als auch die axiale Position von O3 ein, um das Emissionslicht bei 30° zu finden, und stellen Sie dann O3 axial ein, bis das Emissionslicht die hintere Öffnung ausfüllt. Entfernen Sie die Milchglas-Ausrichtungsscheibe zwischen SL2 und TL2, um ein stärkeres Emissionssignal zu erhalten. Schrauben Sie zwei 8-Zoll-Käfigstangen in die Rückseite des O3-Translationstisches. Schieben Sie eine Käfigplatte mit einer montierten Milchglasscheibe auf die Stäbe und stellen Sie dann O3 mit der xy-Halterung fein ein, um sicherzustellen, dass das Emissionslicht zentriert aus O3 austritt. Entfernen Sie dann die Käfigstangen. Montieren Sie eine Milchglasscheibe in der groben Position des Kamerasensors und richten Sie die Höhe und Position der Scheibe am Emissionslicht aus. Montieren Sie TL3 direkt hinter O3. Zentrieren Sie TL3 auf das einfallende Emissionslicht und passen Sie dann die Neigung von TL3 an, um das austretende Licht an der Milchglasscheibe auszurichten. Um den Abstand zwischen TL3-Kamera genauer einzustellen, schrauben Sie O3 vorsichtig ab und montieren Sie den Ausrichtungslaser so, dass er von TL3 auf die Kamera fokussiert wird. Verwenden Sie bei Bedarf ND-Filter, damit die Laserintensität <1 mW beträgt. Starten Sie die Live-Ansicht der Kamera und stellen Sie TL3 axial ein, um den Laserfleck auf der Kamera zu minimieren. Montieren Sie die Milchglas-Ausrichtungsscheibe wieder in der gemeinsamen Brennebene zwischen SL2 und TL2. Montieren Sie die Fluoreszenzfarbstoff-Testprobe und beleuchten Sie die Probe mit dem Anregungsstrahl. Stellen Sie die xy-Verschiebungsknöpfe an der O3-Halterung ein, bis sich das kleine Loch in der Glasausrichtungsscheibe innerhalb des Sichtfelds der Kamera befindet. Stellen Sie den Käfigverschiebetisch so ein, dass O3 axial bewegt wird, bis das Loch scharf ist. Stellen Sie sicher, dass das Loch ähnlich aussieht wie bei 0°. Montieren Sie das positive Gittertestziel wieder auf der gleichen axialen Höhe und beleuchten Sie das Gitter mit dem BF-Licht. Vergewissern Sie sich, dass nur ein vertikaler Abschnitt scharf ist (aufgrund der 30°-Neigung). Verwenden Sie erneut das Rasterbild, um zu bestätigen, dass das Feld über dem Sichtfeld flach ist, auch wenn es unscharf ist. Wenn der Objektträger axial verschoben wird, vergewissern Sie sich, dass der fokussierte Teil des FoV (Rasterziel) horizontal über den Bildschirm schwenkt, während die Rasterquadrate eine konsistente Größe beibehalten (Abbildung 10).HINWEIS: Aufgrund der Neigung der Abbildungsebene an der Probe kann das Gitter in der x-Ebene leicht gestreckt erscheinen. Abbildung 4: Laser-in-Laser-Out-Technik. Senden Sie einen kollimierten Teststrahl durch die Vorderseite von O1 und beobachten Sie den Strahl, der O2 auf einer weit entfernten Oberfläche verlässt. Wenn alle Komponenten im richtigen Abstand ausgerichtet sind, bildet der Strahl eine kleine Airy-Scheibe auf der weit entfernten Oberfläche. Alle Abkürzungen sind die gleichen wie in Abbildung 3. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 5: Verwendung von Emissionslicht zur Ausrichtung. (A) Emissionslicht von einem Acryl-Fluoreszenzobjektträger auf einem anschraubbaren Target hinter dem BFP von O2. (B) Auffinden des Emissionslichts durch Sicht durch die Rückseite von O3. Abkürzungen: O2-O3 = Ziele; BFP = hintere Brennebene. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 6: Kamerabild der korrekt fokussierten Milchglas-Ausrichtungsscheibe. Die Scheibe wurde auf der Zwischenebene zwischen SL2 und TL2 platziert. Maßstabsbalken = 50 μm. Abkürzungen: SL2 = Scanobjektiv; TL2 = Tubuslinse. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 7: Kamerabild der 3D-Perlenprobe. Das Bild zeigt 1-nm-Perlen mit dem auf 0° eingestellten Bildgebungsmodul und einem kreisförmigen Strahl vor dem Einsetzen der Zylinderlinsen. Maßstabsbalken = 50 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 8: Positives Gittertestziel korrekt fokussiert auf der Zwischenebene zwischen SL2 und TL2. Die flachen Gitter über das gesamte Feld zeigen eine gute Ausrichtung der Komponenten SL2 und Prior an. Maßstabsbalken = 30 μm. Abkürzungen: SL2 = Scanobjektiv; TL2 = Tubuslinse. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 9: Kamerabild der 3D-Perlenprobe. Das Bild zeigt 1-nm-Kügelchen, die auf der Zwischenebene zwischen SL2 und TL2 korrekt fokussiert sind. Maßstabsbalken = 30 μm. Abkürzungen: SL2 = Scanobjektiv; TL2 = Tubuslinse. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 10: Positives Gittertestziel mit einem gelben Quadrat gleicher Größe, das überlagert ist, um den Quadraten des Gitters zu entsprechen. (A) Gitter im Fokus auf der linken Seite. (B) Gitter im Fokus auf der rechten Seite. Das gelbe Quadrat entspricht der Größe der Gitterboxen auf beiden Seiten des Sichtfelds. Maßstabsleisten = 30 μm. Abkürzung = FoV = Sichtfeld. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. 4. Ausrichten des schrägen Lichtblatts Entfernen Sie O1 und setzen Sie den doppelten Milchglas-Ausrichtungskäfig wieder ein. Vergewissern Sie sich, dass der Strahl kollimiert und auf beiden Milchglasscheiben zentriert ist. Schrauben Sie die zylindrische Linse 1 (CL1) in eine drehbare Objektivfassung. Montieren Sie CL1 in den Strahlengang und drehen Sie die Montierung so, dass der Strahl in Richtung senkrecht zum optischen Tisch erweitert wird. Stellen Sie die Neigung und die seitliche Position von CL1 so ein, dass der Strahl auf der Vorderseite zentriert ist und eine zentrierte Position auf beiden Milchglasscheiben beibehält. Schrauben Sie die zylindrische Linse 2 (CL2) in eine rotierende Objektivfassung und montieren Sie CL2 im richtigen Abstand in den Strahlengang, um ein 4f-System mit CL1 zu bilden. Drehen Sie CL2 in die gleiche Ausrichtung wie CL1, so dass der Strahl in Richtung senkrecht zum optischen Tisch gestreckt und kollimiert wird. Verwenden Sie eine Testkarte, um die Höhe des zylindrischen Strahlprofils an mehreren Stellen zu messen, um sicherzustellen, dass der Strahl kollimiert ist. Passen Sie die Neigung und die seitliche Position von CL2 an, wie in Schritt 4.2 beschrieben. Schrauben Sie die zylindrische Linse 3 (CL3) in eine rotierende Objektivfassung und montieren Sie CL3 im richtigen Abstand in den Strahlengang, um ein 4f-System mit L3 zu bilden. Drehen Sie CL3 in die gleiche Ausrichtung wie CL1 und CL2, sodass der Strahl in der Fokusebene auf ein horizontales Blattprofil fokussiert wird. Stellen Sie die Neigung und die seitliche Position von CL3 ein, wie in Schritt 4.2 beschrieben. Setzen Sie den Schlitz ein: Montieren Sie den Schlitz mit vier 4-Zoll-Käfigstangen und der CL3-Käfighalterung in vertikaler Ausrichtung in der Brennebene zwischen CL3 und L3, gemessen mit einem Lineal. Verwenden Sie das gestreckte Erregerstrahlprofil, um die Höhe und die seitliche Position des Schlitzes einzustellen, bis er auf dem Balken zentriert ist. Setzen Sie O1 wieder ein, montieren Sie die Fluoreszenzfarbstofftestprobe und beleuchten Sie die Probe mit dem Anregungslichtblatt. Vergewissern Sie sich am Kamerasensor, dass das 0°-Lichtblatt als dünnes vertikales Blatt erscheint (Abbildung 11A). Entfernen Sie die Fluoreszenzfarbstoff-Testprobe und wischen Sie O1 sauber. Lassen Sie das Lichtblatt ungehindert über O1 expandieren. Verschieben Sie M1 mit der motorisierten Verschiebungstischsteuerung in Richtung der Zylinderlinsen, um den Winkel des Lichtblatts auf etwa 60° relativ zur optischen Achse von O1 einzustellen.HINWEIS: Es ist wichtig, dass die Lichtfolie in die richtige Richtung geneigt ist, um mit der ähnlich geneigten Abbildungsebene auszurichten (Abbildung 12). Wenn ein System anders ausgelegt ist als dieses spezifische Design, kann die richtige Richtung der Neigung durch geometrisches Raytracing ermittelt werden.HINWEIS: Als Referenz wird das Lichtblatt in diesem Setup durch Verschieben von M1 um 2,647 mm in Richtung Schlitz auf die richtige Neigung eingestellt. Setzen Sie die Fluoreszenzfarbstoff-Testprobe wieder ein, um das gekippte Blatt abzubilden. Stellen Sie sicher, dass das Lichtblatt eine vertikale Strahlform auf der Kamera beibehalten hat, aber breiter und schwächer ist (Abbildung 11B). Verschieben Sie die Probe axial mit dem Tisch, so dass der Fluoreszenzfarbstoff vom Lichtblatt in fünf verschiedenen Tiefen zwischen der Mitte des Sichtfelds und der rechten Seite des Bildschirms beleuchtet wird. Speichern Sie jedes Bild. Öffnen Sie die Bilder in Fidschi. Wählen Sie für jedes Bild das Linienwerkzeug aus und zeichnen Sie eine horizontale Linie von der Mitte des Sichtfelds zur Mitte des Lichtblatts. Um die Verschiebung zu messen, gehen Sie zu Analysieren | Messen Sie , um die Länge der Linien zu sehen. Zeichnen Sie dann die Verschiebung des Lichtblatts als Funktion der Probentiefe, um den Winkel des Lichtblatts über O1 zu berechnen. Übersetzen Sie M1 leicht. Wiederholen Sie die Schritte 4.9 und 4.10, bis der Winkel der Lichtfolie 60° von der optischen Achse von O1 beträgt, was dem Winkel der Abbildungsebene entspricht. Abbildung 11: Kamerabilder der Fluoreszenzfarbstoff-Testprobe, die von einem korrekt geformten Lichtblatt beleuchtet wird. (A) Das Blatt um 90° gerade nach oben entlang der optischen Achse von O1 und (B) um 30° geneigt (60° zur optischen Achse von O1). Maßstabsbalken = 50 μm. Abkürzung: O1 = Objektiv. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 12: Korrekte Richtung der Lichtblattneigung zur Ausrichtung an der Abbildungsebene von O1. Abkürzung: O1-O3 = Ziele. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. 5. Feinabstimmung des Systems für Bildgebung und Datenerfassung Montieren Sie den 3D-Perlenschlitten und verschieben Sie die Probe axial mit dem Tisch, bis die Perlen das Sichtfeld der Kamera ausfüllen. Passen Sie O3 mit dem xy-Tisch und dem Käfigverschiebetisch an, um Aberrationen zu minimieren und das Signal-Rausch-Verhältnis im Bild zu optimieren (Abbildung 13). Passen Sie den Korrekturring von O1 an, um Aberrationen zu minimieren und das Signal-Rausch-Verhältnis im Bild zu optimieren. Abbildung 13: Kamerabilder der 3D-Perlenprobe (1 μm Perlen), beleuchtet von einem korrekt geformten Lichtblatt. (A) Blatt um 90°, gerade nach oben entlang der optischen Achse von O1, und (B) um 30° zur optischen Achse von O1 geneigt. Das gelbe Kästchen zeigt den Teil des Sichtfelds an, der flach, konsistent und nutzbar ist (80 μm x 80 μm) und in dem zuverlässige Daten erfasst werden können. Maßstabsbalken = 50 μm. Abkürzungen: O1 = Objektiv; FoV = Sichtfeld. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. 6. Kalibrierung der Vergrößerung des Systems Montieren Sie das positive Gittertesttarget auf dem Probentisch und beleuchten Sie es mit dem Hellfeldlicht. Verschieben Sie die Rasterfolie axial mit der Bühne, um die Rasterfolie in den Fokus zu bringen. Bringen Sie die Mitte des Rasters in den Fokus. Nehmen Sie das Bild auf, speichern Sie es und öffnen Sie es dann in Fidschi. Verwenden Sie das Linienwerkzeug und die Funktion “Messen” in Fidschi, um den Abstand zwischen zwei Rasterlinien in Pixeln genau zu messen. Teilen Sie diesen Wert durch den bekannten Abstand (10 μm), um die Pixel-zu-Mikron-Kalibrierung zu bestimmen. Berechnen Sie die Vergrößerung (M) des Systems anhand der gemessenen Größe des Pixels und der bekannten Größe eines Pixels mit Gleichung (1).(1) 7. Erfassung volumetrischer Scans Positionieren Sie die Probe.Schalten Sie die Kameravorschau, den Galvo, den Funktionsgenerator, das Netzteil, die Bühne und den Anregungslaser ein. Montieren Sie das Sample und klicken Sie dann auf die FSK-Taste am Funktionsgenerator, um eine Dreieckswelle einzustellen. Um das Sample zu finden, verwenden Sie den Funktionsgenerator, um Folgendes einzustellen: 400 mV Peak-to-Peak-Amplitude (mit der Ampl. -Taste), 0 Offset (mit der Offset-Taste ) und 200 mHz Frequenz. Verwenden Sie das Micromanager-Fenster , um eine Belichtungszeit von 100 ms einzustellen. Scrollen Sie manuell in z, bis die Abtastebene erreicht ist. Optimieren Sie die z-Einstellung so, dass der gewünschte Bereich für den volumetrischen Scan während eines Zyklus durch den Bildschirm läuft. Wählen Sie die Scan-Parameter aus.Stellen Sie sicher, dass die Peak-to-Peak-Amplitude richtig eingestellt ist, indem Sie visuell überprüfen, ob die Vorschau für die Dauer des Scans scharf zu sein scheint. Wenn sich die Bildqualität an einem Ende des Scans früher verschlechtert als am anderen, bearbeiten Sie den Versatz des Funktionsgenerators, um die Mitte des Scans in den besseren Bereich zu verschieben. Wählen Sie im Micromanager-Programm eine Belichtungszeit aus und klicken Sie auf Multi-D-Erfassung , um das Fenster Multidimensionale Erfassung zu öffnen. Verwenden Sie das Feld Anzahl , um die Anzahl der Frames auszuwählen, wodurch die Gesamterfassungszeit festgelegt wird. Das Intervall zwischen den Bildern (Bildrate) wird durch die Belichtungszeit festgelegt, es sei denn, im Feld Intervall ist ein längeres Intervall angegeben. Stellen Sie im Funktionsgenerator die Frequenz so ein, dass ein vollständiger Volumenscan um die Hälfte der Periode der Dreieckswellenfunktion (linearer Scan in eine Richtung) erstellt wird.HINWEIS: Wenn die Bildrate und -frequenz zu niedrig sind, werden zu wenige Bilder für einen Volume-Scan erfasst, und die niedrige Bildzahl führt zu sichtbaren Artefakten in der Nachbearbeitung. Als Referenz bestand Abbildung 13 aus ~100 Frames im Scan und Abbildung 14 aus ~800. Bei der Auswahl der Parameter ist es auch wichtig, die Probe selbst zu berücksichtigen. Es ist darauf zu achten, dass die Belichtungszeit so eingestellt ist, dass die Probe ausreichend angeregt, aber nicht gesättigt ist. Dazu kann auch die Intensität des Anregungslasers eingestellt werden. Wenn der Benutzer eine Reihe von volumetrischen Scans erfasst, um einen zeitvariablen Prozess in 3D zu charakterisieren, stellen Sie sicher, dass die Scanzeitskala die Zeitskalendynamik des Systems überschreitet. Sammeln von Videos: Erfassen Sie einen Zeitraffer, der mindestens die Dauer eines vollständigen Hoch- oder Abfahrens der Dreieckswelle erfasst, was einem vollständigen Scan der Lautstärke entspricht. 8. Nachbearbeitungsverfahren Entzerren volumetrischer BildstapelEntzerren Sie die Volumenscans, um den Stapel von Bildern in geneigten Ebenen in eine Reihe von Bildern mit echten xyz-Koordinaten zu konvertieren.HINWEIS: Es gibt viele hervorragende Anleitungen zur Nachbearbeitung von Light-Sheet-Bildern und Open-Source-Software, um das Entzerren vorhandener Volumenscans durchzuführen sowie das Entzerren durchzuführen und entzerrte Bilder während der Erfassungzu speichern 24. Um die Volumenscans zu entzerren, erhalten Sie die folgenden beiden Parameter: den tatsächlichen Abstand zwischen zwei Bildern in Pixel (d) und den Winkel zwischen der Bildebene und der x-y-Ebene (θ wird durch den Winkel des schrägen Lichtblatts (in diesem System 30°) festgelegt). Der Abstand zwischen den Bildern hängt von der Abbildungsoptik und den Aufnahmeeinstellungen ab. Den d-Parameter findenKalibrieren Sie den Abstand zwischen den Frames für jedes Mal, wenn das System grundlegend neu ausgerichtet wird. Führen Sie diese Kalibrierung mit einem Stapel von Bildern von fluoreszierenden Kügelchen durch, da diese für die Diagnose von Problemen am einfachsten zu verwenden sind. Rufen Sie einen Stapel von Bildern ab, und führen Sie den Entzerrungscode mit einer beliebigen anfänglichen Schätzung für den d-Parameter aus. Öffnen Sie den entzerrten Bildstapel in ImageJ, und scrollen Sie durch den Stapel. Wenn d wesentlich weit von seinem tatsächlichen Wert entfernt ist, beachten Sie, dass die Perlen in x oder y künstlich verlängert erscheinen und sich einzelne Perlen in der xy-Ebene zu bewegen scheinen, wenn der Benutzer durch die Frames in z scrollt (anstatt vom selben zentralen Punkt aus zu fokussieren und zu defokussieren). Iterieren Sie mehrmals über den d-Parameter, bis diese Probleme nicht mehr offensichtlich sind. Sobald der d-Parameter einigermaßen nahe am wahren Wert zu liegen scheint, berechnen Sie die Projektionen der maximalen Intensität des Bildstapels entlang der x- und y-Richtung. Beachten Sie, dass Perlen mit einem Durchmesser nahe der Beugungsgrenze in z länglich erscheinen können, aber idealerweise nicht konisch erscheinen oder diagonal verlängert sein sollten. Optimieren Sie die Entzerrungsparameter, bis sich diese Kriterien mit neuen Iterationen nicht wesentlich verbessern. Als Referenz wurden die in Abbildung 13 gezeigten Daten bei d = 2,50 Pixel und die Daten in Abbildung 14 bei d = 1,0 Pixel entzerrt.HINWEIS: Der Abstand zwischen den Bildern hängt linear von der Scanamplitude, -frequenz und -bildrate ab.