Diseño y construcción de un microscopio de fluorescencia de lámina de luz personalizable de un solo objetivo para la visualización de redes de citoesqueletos

1. Preparación para la alineación Antes de comenzar la compilación, realice las revisiones bibliográficas necesarias para tener una idea clara del caso de uso previsto (por ejemplo, los fluoróforos que se van a obtener imágenes, el volumen de imagen necesario, los requisitos de resolución). En particular, consulte la sección de resultados representativos a continuación para decidir si es apropiado seguir el diseño exacto descrito aquí. Si es así, vaya al paso 1.2. Si no es así, encuentre sugerencias y orientación para la selección de hardware en la Guía de compilación de Sheunglab SOLS23.NOTA: El usuario puede encontrar más información sobre las especificaciones de este sistema en particular en la sección de discusión. Reúna todos los componentes ópticos, optomecánicos y eléctricos necesarios como se detalla en la Tabla de Materiales. Para los usuarios que modifican el sistema, recopile todas las partes equivalentes. Construya el láser de alineación como se muestra en la Figura 2A. Compruebe que la viga está colimada utilizando la placa de corte. Construya la jaula de alineación de disco de vidrio esmerilado doble como se muestra en la Figura 2B. Prepare la muestra de prueba recubierta de colorante fluorescente.Cree una solución saturada de colorante de rodamina agregando gradualmente 1 ml de agua destilada a 0,2 g de polvo liofilizado hasta que se disuelva por completo. Vórtice para homogeneizar.NOTA: Esta solución es sensible a la luz. Aunque no hay precauciones necesarias durante la preparación, asegúrese de que la solución se almacene en un área oscura después de haber sido preparada.PRECAUCIÓN: Siempre use guantes y una máscara cuando manipule polvo de rodamina. Pipetear 10 μL en el centro de un portaobjetos. Coloque un cubreobjetos de 22 mm x 22 mm encima del líquido, asegurándose de que la capa de fluorescencia sea lo más fina posible. Selle con esmalte de uñas transparente.NOTA: Esta muestra es sensible a la luz. Para maximizar la vida útil de la muestra, asegúrese de que el portaobjetos se almacene en un área oscura cuando no esté en uso. Prepare la muestra de perlas 3D (perlas de 1 μm incrustadas en gel).Utilice cinta adhesiva de doble cara para crear un canal vertical de 4-5 mm de ancho en un portaobjetos de muestra de tres capas de cinta adhesiva de altura. Coloque una cubierta de vidrio de 22 mm x 22 mm encima de la cinta en el centro de la diapositiva. Presione firmemente las regiones pegadas con cinta adhesiva para asegurar un buen sellado entre la cinta y el cubreobjetos. Usa una cuchilla de afeitar para quitar el exceso de cinta. Prepare 125 ml de solución saturada de goma gellan agregando gradualmente agua desionizada a 1 g de goma gellan en polvo. Esta solución será sólida a temperatura ambiente y líquida a 65 °C. Introducir 1 ml de solución de goma gellan en un tubo de microcentrífuga. Calentar un recipiente con agua en una placa calefactora a 65 °C y calentar el tubo de microcentrífuga hasta que la goma gellan esté visiblemente viscosa. Preparar 10 μL de una dilución 1:1.000 de perlas en una solución de goma gellan tibia. Pipetee con cuidado la solución en la cámara hasta que esté llena. Use un palillo de dientes para aplicar una pequeña cantidad de epoxi en ambos lados del canal, cubriendo completamente las aberturas para sellar. Para garantizar un sellado adecuado, inspeccione visualmente ambos extremos para asegurarse de que el epoxi haya penetrado ligeramente en cada extremo del canal. Figura 2: Fotos de las herramientas de alineación. (A) Láser de alineación colimado. AL1: Lente de alineación 1, −50 mm; AL2: Lente de alineación 2, 100 mm (B) Doble jaula de alineación de disco de vidrio esmerilado. Abreviaturas: RMS CP = placa de jaula roscada RMS; SM1 CP = Placa de jaula roscada SM1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 2. Alineación de la trayectoria de excitación Dibuje el diseño del microscopio en la superficie de la mesa óptica. Mide todas las distancias con la mayor precisión posible.NOTA: Consulte la Figura 3 para conocer la ubicación de los componentes dentro del sistema. Monte el láser de excitación sobre la mesa. Coloque dos iris a la altura prevista del láser y móntelos a una distancia de 2 a 3 pies en la línea deseada de orificios detrás de la ubicación del Espejo 1 (M1). Utilice estos iris para asegurarse de que el haz esté nivelado con la superficie de la mesa y centrado en la línea de orificios de la mesa óptica.NOTA: Use gafas de seguridad láser para proteger los ojos y bloquee cualquier rayo láser disperso con pantallas de seguridad láser como medida de seguridad. Hasta que todos los componentes estén sujetos de forma permanente, es posible que se produzcan derivas del orden de horas. Coloque un iris en el punto más alejado de la alineación al final de cada día como una comprobación visual rápida de la deriva al regresar a la construcción. Las vibraciones, una mesa óptica mal flotada y las corrientes de aire son las causas más comunes de la deriva óptica. Monte el obturador láser lo más cerca posible del láser de excitación. Utilice este obturador para bloquear rápidamente la luz láser durante la alineación, en lugar de encender y apagar repetidamente el láser. Ensamble los filtros ND en la rueda de filtros ND (ND 0.5, 1.0. 2.0, 3.0, 4.0 y una ranura en blanco) y móntelos después del obturador láser. Coloque el actuador motorizado en una etapa de traslación (TS1) y, a continuación, inserte la platina debajo de la ubicación de M1. Asegúrese de que la platina se traslade axialmente a lo largo de la misma línea de orificios que sigue la luz láser. Coloque el escenario en el medio de su rango para la colocación inicial.En los siguientes pasos 2.6-2.10, inserte los componentes ópticos reflectantes en la trayectoria del haz de uno en uno para dirigir el láser a lo largo de la trayectoria tal como se dibuja en la tabla. Utilice el par de iris ajustados a la altura exacta para definir la trayectoria deseada del haz de salida y guiar la colocación y alineación de cada elemento reflectante. Para cada elemento, ajuste la altura y la posición del soporte para asegurarse de que la viga entrante golpee el centro. Luego, gire la base de la montura para dirigir la viga a lo largo de la trayectoria de la viga alargada en la mesa para que pase a través de ambos lirios, y ajuste con precisión la inclinación de la viga saliente con las perillas en la parte posterior de cada montura.NOTA: Después de que cada elemento esté alineado a la altura correcta, agregue un collar deslizante al poste para asegurar la altura. Monte y alinee M1 en la parte superior de TS1. Monte y alinee el dicroico sobre la mesa. Siguiendo las instrucciones del fabricante, conecte el galvo a la fuente de alimentación y al generador de funciones. Monte el galvo de tal manera que el láser incida en el centro exacto del espejo. Encienda el galvo y, a continuación, mantenga pulsado el botón AM del generador de forma de onda para ajustar la inclinación del espejo a una corriente de 0 V CC (centro del rango). Ahora, alinea el galvo con los iris. Monte y alinee el espejo 2 (M2). Inserte el espejo cilíndrico grande en el soporte del espejo cilíndrico. Utilice varillas de jaula de 1 pulgada para fijar un adaptador de jaula de 30-60 mm por encima del espejo 3 (M3). Utilice las perillas del soporte del espejo para aplanar la inclinación del espejo M3 para la colocación inicial. Monte la jaula de alineación de vidrio esmerilado doble en el adaptador de jaula por encima de M3; Asegúrese de apretar los tornillos de fijación del adaptador de la jaula que mantienen la jaula de alineación en su lugar cada vez que se utilice para la alineación. Monte M3 en la mesa y ajuste la altura y la posición hasta que la viga esté aproximadamente centrada en ambos discos de alineación de vidrio esmerilado. Sujete el M3 a la mesa y use un soporte de poste, un poste de 3 pulgadas, una abrazadera de 90° y un poste de 2 pulgadas a ambos lados del M3 para agregar soporte usando los orificios sellados con cinta adhesiva a cada lado del soporte del espejo. Use las perillas en la parte posterior del espejo para ajustar con precisión el haz.NOTA: Todos los elementos reflectantes en la trayectoria de excitación ahora están configurados y no deben tocarse. Monta la lente 1 (L1) en la mesa. Para todas las colocaciones iniciales de la lente, use un objetivo de lente atornillado para centrar el haz entrante en la parte frontal de la lente. Ajuste la inclinación y la posición lateral de la lente 1 (L1) hasta que el haz esté centrado en las dos placas de vidrio esmerilado de la jaula de alineación por encima de M3. Monta la lente 2 (L2) en su posición respectiva para crear un sistema 4f con L1. Mueva L2 axialmente para obtener un haz colimado y use el láser de excitación y la placa de corte para verificar la colimación. Ajuste la inclinación y la posición lateral de L2 para centrar el haz en los dos discos de vidrio esmerilado por encima de M3. Monte el orificio en un soporte de traslación xy. Móntelo en la parte superior de una plataforma de traslación 1D para proporcionar una traslación axial fina. Monte el estenopeico y el escenario en un poste y soporte de poste, y colóquelo en el punto focal compartido entre L1 y L2. Ajuste el orificio con la mano hasta que la luz láser se pueda ver a través del orificio. Monte el sensor del medidor de potencia inmediatamente después del agujero de alfiler y use el botón de longitud de onda en la consola digital del medidor de potencia para seleccionar la longitud de onda del láser de excitación. Ajuste la posición xy del orificio para maximizar la transmisión y obtener un perfil de haz cercano a TEM00. A continuación, ajuste el agujero axialmente con la platina 1D para maximizar aún más la transmisión. Monta la lente 4 (L4) en la mesa en su posición y ajusta la montura a la altura correcta. Ajuste L4 axialmente para que el haz de excitación se enfoque en la superficie del galvo. Ajuste la inclinación y la posición lateral de L4 para centrar el haz en los dos discos de vidrio esmerilado por encima de M3. Monta la lente 3 (L3) en la mesa en su posición y ajusta la montura a la altura correcta. Utilice el láser de excitación y la placa de cizallamiento para comprobar la colimación de L3 y L4. Ajuste la inclinación y la posición lateral de L3 para centrar el haz en los dos discos de vidrio esmerilado por encima de M3. Elimine temporalmente L3. Monte la lente de barrido 1 (SL1) en la mesa y ajuste la distancia axial para formar un telescopio colimado con L4, medido con la placa de corte. Ajuste la inclinación y la posición lateral de SL1 para centrar el haz en los dos discos de vidrio esmerilado por encima de M3. Vuelva a insertar L3. Monte la lente de tubo 1 (TL1) y use el haz de excitación y la placa de corte para colimar SL1 y TL1. Ajuste la inclinación y la posición lateral de TL1 para centrar el haz en los dos discos de vidrio esmerilado por encima de M3. Con un anillo adaptador, atornille el objetivo 1 (O1) en la placa de la jaula por encima de M3. Retire SL1 temporalmente y deje que la viga toque el techo. Ajuste la altura (distancia axial) de O1 en el sistema de jaula hasta que la viga forme un disco de Airy en el techo y, a continuación, continúe ajustando hasta que se minimice el tamaño del disco. Con O1 en su lugar, monte la platina de muestra en la posición adecuada. Figura 3: Ubicación de los componentes dentro del sistema SOLS. (A) Esquema del sistema SOLS con todos los componentes etiquetados. (B) Foto de arriba hacia abajo del sistema SOLS físico en la mesa óptica, excluyendo el área de la etapa de muestra. (C) Foto de arriba hacia abajo del área de la etapa de la muestra (extensión a la Figura 3B). La trayectoria de excitación se muestra en verde. La ruta de emisión se muestra en rojo. Distancias focales de las lentes: L1: 100 mm; L2: 45 mm; CL1: 50 mm; CL2: 200 mm; CL3: 100 mm; L3: 150 mm; L4: 100 mm; SL1: 75 mm; TL1: 200 mm; SL2: 150 mm; TL2: 125 mm; TL3: 200 mm. Consulte la Tabla de materiales para obtener especificaciones más detalladas de las piezas. Abreviaturas: SOLS = hoja de luz de un solo objetivo; ND Wheel = rueda de filtros de densidad neutra variable; L1-L4 = lentes acromáticas cóncavas planas; CL1-CL3 = lentes cilíndricas; M1-M3 = espejos; TS1-TS2 = etapas de traducción; DM = espejo dicroico; Galvo = galvanómetro de barrido; SL1-SL2 = lentes de exploración; TL1-TL2 = lentes de tubo; O1-O3 = objetivos; EF = filtro de emisiones. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 3. Alineación de la trayectoria de emisión Configure el láser de alineación.Monte dos placas de jaula vacías al lado del láser de excitación a la misma altura que el láser. Utilice estas placas de jaula para montar el láser de alineación deslizando las varillas de la jaula del láser de alineación en los orificios vacíos de las dos placas de jaula. Asegúrese de que el láser se pueda configurar en la posición de encendido, ya sea pegando alrededor del botón de encendido o cableando un interruptor de encendido/apagado. Retire O1 y vuelva a insertar la jaula de alineación de vidrio esmerilado. Utilice un soporte de espejo cinemático y un espejo desplegable para alinear el haz de alineación con la trayectoria del haz de excitación. Utilice el medidor de potencia para maximizar la señal del haz de alineación después del agujero de alfiler ajustando con precisión los dos espejos. Asegúrese de que la viga permanezca centrada en la jaula de alineación de vidrio esmerilado. Retire la jaula de alineación y vuelva a insertar O1. Coloque el espejo cuadrado en la etapa de muestra de O1 y ajuste el espejo axialmente hasta que el tamaño del perfil del haz se minimice después del dicroico. Monte un iris en la ruta de emisión y lo suficientemente atrás como para que la lente de escaneo 2 (SL2), la lente de tubo 2 (TL2) y el objetivo 2 (O2) se puedan insertar sin interferencias. Alinee este iris con el láser de alineación. Monte un disco de vidrio esmerilado al menos 1 pulgada detrás del iris y asegúrese de que también esté alineado con la luz láser. Inserte SL2 a la distancia correcta, medida desde el galvo con una regla. Ajuste la inclinación y la posición lateral de SL2 para que el haz de alineación entrante quede centrado en SL2 y el haz saliente pase a través del iris y el disco de vidrio esmerilado. Inserte TL2 a la distancia correcta, medida desde SL2 con una regla. Ajuste la inclinación y la posición lateral de TL2 para que la viga de alineación entrante esté centrada en TL2 y la viga saliente pase a través del iris y el disco de vidrio esmerilado. Monte TS2 en la mesa. Asegúrese de que la etapa se traslade a lo largo del eje óptico de O2. Atornille O2 en un soporte de traslación xy. Conecte un poste debajo de la montura xy para montar O2 en la platina de traducción. Utilice un objetivo de rosca para centrar la parte posterior de O2 en el láser rojo. Ajuste las perillas xy y la inclinación de O2 para que el haz de alineación rojo pase a través del iris y el disco de vidrio esmerilado. Mueva el láser de alineación por encima de O1 y diríjalo hacia abajo en la trayectoria de emisión. Encienda el láser y asegúrese de que este haz esté centrado en todas las lentes en la ruta de emisión. Conjugue los planos de pupila de O1 y O2 abriendo el iris y retirando el disco de vidrio esmerilado de modo que el haz de alineación que sale de O2 continúe sin obstrucciones hacia una superficie o pared lejana (>0,5 m) (Figura 4). Ajuste TS2 hasta que el haz forme un pequeño disco de Airy en la superficie y, a continuación, continúe ajustando TS2 para minimizar el tamaño del disco de Airy.NOTA: Un haz muy divergente indica la colocación incorrecta del O2. Sin embargo, debido a que este haz pasa a través de dos objetivos, una pequeña cantidad de divergencia es inherente. Como tal, el disco Airy es la mejor guía. Optimice el galvo para el escaneo invariante de inclinación: presione el botón FSK en el generador de forma de onda para seleccionar una señal de onda triangular para el galvo y configúrela en una frecuencia baja (~ 1 Hz). Observe la viga de alineación en la misma superficie o pared lejana.NOTA: Si el galvo se coloca incorrectamente, la viga barrerá horizontalmente la superficie junto con el movimiento del galvo. Esto se puede resolver mediante ajustes finos (a mano) de la posición de inclinación y xy de la base galvo hasta que el desplazamiento del haz sea indetectable a simple vista. Compruebe la calidad del sistema mediante imágenes a 0°.Atornille O3 en un soporte de traslación xy. Atornille un tubo de lente de 1 pulgada en la etapa de traslación de la jaula y atornille la etapa de traslación xy en el tubo. Utilice dos varillas de jaula para conectar la parte delantera de la etapa de traslación de la jaula a una placa de jaula y monte la placa de la jaula en un poste. Monte el objetivo 3 (O3) cerca de la parte delantera de O2 (~4-5 mm) a 0° y ajuste la altura para que coincida. Monte un disco de alineación de vidrio esmerilado en el plano focal compartido entre SL2 y TL2, medido con una regla. Monte el portaobjetos de prueba fluorescente acrílico en el escenario e ilumine el portaobjetos con el láser de excitación. Mire a través de la parte posterior de O3, ajuste tanto la altura como la posición axial de O3 para encontrar la luz de emisión y, a continuación, ajuste O3 axialmente hasta que la luz de emisión llene la abertura posterior (Figura 5). Atornille dos varillas de jaula de 8 pulgadas en la parte posterior de la etapa de traslación de O3. Deslice una placa de jaula con un disco de vidrio esmerilado montado sobre las varillas y luego ajuste el O3 con el soporte xy para asegurarse de que la luz de emisión salga centrada en el O3. Luego, retire las varillas de la jaula. Monte un disco de vidrio esmerilado en la posición aproximada del sensor de la cámara y alinee la altura y la posición del disco con la luz de emisión. Atornille la lente de tubo 3 (TL3) en una placa de jaula y móntela inmediatamente detrás de O3. Centre TL3 en la luz de emisión entrante y, a continuación, ajuste la inclinación de TL3 para alinear la luz saliente con el disco de vidrio esmerilado. Monta la cámara a la distancia correcta de la lente de tubo, medida con una regla. Atornille los tubos de lente de 2 pulgadas y el filtro de emisión en la cámara. Vuelva a montar el disco de alineación de vidrio esmerilado en el plano focal compartido entre SL2 y TL2. Monte la muestra de prueba de colorante fluorescente e ilumine la muestra con el haz de excitación. Encienda la cámara y, a continuación, abra el programa Micromanager en el equipo conectado. Haga clic en En vivo para ingresar a la vista en vivo. Haga clic en Automático una vez para establecer la configuración de exposición inicial y, a continuación, restablezca la exposición según sea necesario al tomar imágenes.NOTA: Micromanager no funcionará correctamente a menos que se abra después de que se haya encendido la cámara. Ajuste las perillas de traslación xy en la montura O3 hasta que el pequeño orificio en el disco de alineación de vidrio esté centrado dentro del campo de visión (FoV). Ajuste O3 axialmente con la etapa de traslación de la jaula hasta que el orificio esté enfocado; los bordes deben aparecer afilados (Figura 6). Imágenes de perlas fluorescentes para comprobar la calidad del sistema. Retire el disco de alineación de vidrio esmerilado, monte la muestra de perlas 3D e ilumine la muestra con el haz de excitación. Ajuste la altura de la muestra en relación con O1 hasta que las perlas fluorescentes llenen una región circular en el centro del campo de visión. Ajuste con precisión la posición de O3 utilizando la etapa xy y la etapa de traslación axial hasta que las funciones de dispersión puntual (PSF) sean redondas (indicativas de aberraciones mínimas) y brillantes (indicativas de una buena relación señal-ruido) (Figura 7). Si esto no se puede lograr ajustando O3, es muy probable que el sistema óptico entre los componentes O1 y O2 no esté alineado de manera óptima; Siga las comprobaciones diagnósticas del paso 3.13 a continuación. Si se pueden obtener PSF redondos , omita el paso de diagnóstico y continúe con la inclinación del sistema de imágenes. Realice comprobaciones diagnósticas si es necesario.NOTA: Una vez que se obtienen buenos PSF, se pueden omitir el resto de los pasos de diagnóstico.Monte la luz de campo claro (BF) por encima de O1. Monte el objetivo de prueba de rejilla positiva en la platina de muestra a la misma altura axial que el espejo de alineación. Centre la rejilla de 10 μm e ilumine la rejilla con la luz BF. Cree una imagen de la cuadrícula en la cámara y traslade la muestra hasta que la cuadrícula esté enfocada. Utilice la imagen de la cuadrícula para confirmar que el campo a través del campo de visión es plano: de lo contrario, la cuadrícula aparecerá distorsionada y arqueada. Para corregir una mala imagen de cuadrícula, ajuste la posición xyz y la inclinación de O3 y, a continuación, ajuste el TL3 y la cámara en consecuencia.NOTA: Si se puede lograr una cuadrícula plana, repita el paso 3.12.10 y luego continúe con la inclinación del sistema de imágenes. Configure la cámara de alineación o la cámara de imágenes a la distancia correcta para que SL2 enfoque la imagen en el sensor. Imagine el objetivo de la cuadrícula en el plano intermedio (Figura 8). Si esta cuadrícula también está sesgada, es muy probable que el sistema óptico entre los componentes O1 y SL2 no esté alineado de manera óptima y deba revisarse. Optimice la alineación según sea necesario antes de avanzar.NOTA: Si la cámara no encaja entre SL2 y TL2, utilice un espejo adicional para hacer rebotar la imagen 90° después de SL2 y sobre la cámara. Verifique los PSF en el plano intermedio: Después de verificar la cuadrícula, otra buena verificación de diagnóstico es verificar los PSF en el mismo plano intermedio. Una buena imagen en este plano, que es similar a la Figura 7 pero con un aumento diferente (Figura 9), indica una buena alineación a través de SL2.NOTA: Si se puede lograr una cuadrícula plana y PSF redondas en el plano intermedio, repita el paso 3.13.2, luego el paso 3.12.10 y luego continúe con la inclinación del sistema de imágenes. Incline el subsistema de imágenes de O3 a 30°.Retire O3, TL3 y la cámara. Vuelva a insertar O3 a 30° en el eje óptico de O2 utilizando las líneas de la mesa como guía. Monte un disco de alineación de vidrio esmerilado en el plano focal compartido entre SL2 y TL2. Monte el portaobjetos de prueba fluorescente acrílico en el escenario e ilumine el portaobjetos con el láser de excitación. Una vez más, mire a través de la parte posterior de O3, ajuste tanto la altura como la posición axial de O3 para encontrar la luz de emisión a 30 ° y luego ajuste O3 axialmente hasta que la luz de emisión llene la abertura posterior. Retire el disco de alineación de vidrio esmerilado entre SL2 y TL2 para obtener una señal de emisión más fuerte. Atornille dos varillas de jaula de 8 pulgadas en la parte posterior de la etapa de traslación de O3. Deslice una placa de jaula con un disco de vidrio esmerilado montado sobre las varillas y luego ajuste el O3 con el soporte xy para asegurarse de que la luz de emisión salga centrada en el O3. Luego, retire las varillas de la jaula. Monte un disco de vidrio esmerilado en la posición aproximada del sensor de la cámara y alinee la altura y la posición del disco con la luz de emisión. Monte TL3 inmediatamente detrás de O3. Centre TL3 en la luz de emisión entrante y, a continuación, ajuste la inclinación de TL3 para alinear la luz saliente con el disco de vidrio esmerilado. Para establecer con mayor precisión la distancia de la cámara TL3, desenrosque con cuidado el O3 y monte el láser de alineación de modo que TL3 lo enfoque en la cámara. Utilice filtros ND según sea necesario para que la intensidad del láser sea de <1 mW. Inicie la visualización en directo de la cámara y ajuste TL3 axialmente para minimizar el punto láser en la cámara. Vuelva a montar el disco de alineación de vidrio esmerilado en el plano focal compartido entre SL2 y TL2. Monte la muestra de prueba de colorante fluorescente e ilumine la muestra con el haz de excitación. Ajuste las perillas de traslación xy en la montura O3 hasta que el pequeño orificio en el disco de alineación de vidrio esté dentro del campo de visión de la cámara. Ajuste la etapa de traslación de la jaula para mover O3 axialmente hasta que el orificio esté enfocado; Asegúrese de que el orificio se vea similar a como lo hizo a 0°. Vuelva a montar el objetivo de prueba de rejilla positiva a la misma altura axial e ilumine la rejilla con la luz BF. Confirme que solo una sección vertical esté enfocada (debido a la inclinación de 30°). Una vez más, use la imagen de cuadrícula para confirmar que el campo a través del campo de visión es plano, incluso cuando está desenfocado. Cuando la diapositiva se traslada axialmente, confirme que la parte enfocada del campo de visión (objetivo de cuadrícula) se desplaza a través de la pantalla horizontalmente, mientras que los cuadrados de la cuadrícula mantienen un tamaño constante (Figura 10).NOTA: Debido a la inclinación del plano de imagen en la muestra, la cuadrícula puede aparecer ligeramente estirada en el plano x. Figura 4: Técnica de entrada y salida de láser. Enviando un haz de prueba colimado a través del frente de O1 y observando el haz que sale de O2 en una superficie lejana. Si todos los componentes están alineados a la distancia correcta, el haz formará un pequeño disco de Airy en la superficie lejana. Todas las abreviaturas son las mismas que en la Figura 3. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 5: Utilización de la luz de emisión para la alineación. (A) Luz de emisión de un portaobjetos fluorescente acrílico en un objetivo atornillado detrás del BFP de O2. (B) Encontrar la luz de emisión a través de la parte posterior de O3. Abreviaturas: O2-O3 = objetivos; BFP = plano focal posterior. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 6: Imagen en la cámara del disco de alineación de vidrio esmerilado correctamente enfocado. El disco se colocó en el plano intermedio entre SL2 y TL2. Barra de escala = 50 μm. Abreviaturas: SL2 = lente de barrido; TL2 = lente de tubo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 7: Imagen de la cámara de la muestra de cuentas 3D. La imagen muestra perlas de 1 nm con el módulo de imagen ajustado a 0° e iluminado por un haz circular antes de la inserción de las lentes cilíndricas. Barra de escala = 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 8: Objetivo de prueba de cuadrícula positiva correctamente enfocado en el plano intermedio entre SL2 y TL2. Las cuadrículas planas a lo largo de todo el campo indican una buena alineación de los componentes SL2 y anteriores. Barra de escala = 30 μm. Abreviaturas: SL2 = lente de barrido; TL2 = lente de tubo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 9: Imagen de la cámara de la muestra de cuentas 3D. La imagen muestra perlas de 1 nm correctamente enfocadas en el plano intermedio entre SL2 y TL2. Barra de escala = 30 μm. Abreviaturas: SL2 = lente de barrido; TL2 = lente de tubo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 10: Objetivo de prueba de cuadrícula positiva con un cuadrado amarillo de tamaño consistente superpuesto para que coincida con los cuadrados de la cuadrícula. (A) Cuadrícula enfocada en el lado izquierdo. (B) Cuadrícula enfocada en el lado derecho. El cuadrado amarillo coincide con el tamaño de los cuadros de cuadrícula a ambos lados del campo de visión. Barras de escala = 30 μm. Abreviatura = FoV = campo de visión. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 4. Alineación de la lámina de luz oblicua Retire O1 y vuelva a insertar la jaula de alineación de vidrio esmerilado doble en su lugar. Confirme que el haz está colimado y centrado en ambos discos de vidrio esmerilado. Atornille la lente cilíndrica 1 (CL1) en una montura de lente giratoria. Monte CL1 en la trayectoria óptica y gire la montura para que el haz se expanda en la dirección vertical a la mesa óptica. Ajuste la inclinación y la posición lateral de CL1 para que la viga esté centrada en la parte delantera y mantenga una posición centrada en ambos discos de vidrio esmerilado. Atornille la lente cilíndrica 2 (CL2) en una montura de lente giratoria y monte CL2 en la trayectoria óptica a la distancia correcta para formar un sistema 4f con CL1. Gire CL2 a la misma orientación que CL1 para que el haz se estire en la dirección vertical a la mesa óptica y se colime. Utilice una tarjeta de prueba para medir la altura del perfil de la viga cilíndrica en varias ubicaciones para asegurarse de que la viga esté colimada. Ajuste la inclinación y la posición lateral de CL2, como se realiza en el paso 4.2. Atornille la lente cilíndrica 3 (CL3) en una montura de lente giratoria y monte la CL3 en la trayectoria óptica a la distancia correcta para formar un sistema 4f con L3. Gire CL3 a la misma orientación que CL1 y CL2 para que la viga se enfoque hacia abajo hasta un perfil de chapa horizontal en el plano focal. Ajuste la inclinación y la posición lateral de CL3, como se realizó en el paso 4.2. Inserte la ranura: Usando cuatro varillas de jaula de 4 pulgadas y el soporte de jaula CL3, monte la ranura en una orientación vertical en el plano focal entre CL3 y L3, medido con una regla. Utilice el perfil de la viga de excitación estirada para ajustar la altura y la posición lateral de la hendidura hasta que quede centrada en la viga. Vuelva a insertar O1, monte la muestra de prueba de colorante fluorescente e ilumine la muestra con la hoja de luz de excitación. En el sensor de la cámara, confirme que la lámina de luz de 0° aparece como una lámina vertical delgada (Figura 11A). Retire la muestra de prueba de tinte fluorescente y limpie O1. Deje que la hoja de luz se expanda por encima de O1 sin obstrucciones. Usando el control de platina de traslación motorizado, traslade M1 hacia las lentes cilíndricas para establecer el ángulo de la lámina de luz en aproximadamente 60° en relación con el eje óptico de O1.NOTA: Es crucial que la lámina de luz esté inclinada en la dirección correcta para alinearse con el plano de imagen inclinado de manera similar (Figura 12); Si un sistema se presenta de manera diferente a este diseño específico, la dirección correcta de la inclinación se puede determinar a través del trazado de rayos geométricos.NOTA: Como referencia, al trasladar M1 2.647 mm hacia la ranura, coloque la hoja de luz en la inclinación correcta en esta configuración. Vuelva a insertar la muestra de prueba de tinte fluorescente para obtener imágenes de la hoja inclinada. Asegúrese de que la lámina de luz haya mantenido una forma de haz vertical en la cámara, pero sea más ancha y tenue (Figura 11B). Transfiera la muestra axialmente con la platina de modo que el tinte fluorescente sea iluminado por la lámina de luz a cinco profundidades diferentes entre el centro del campo de visión y el lado derecho de la pantalla. Guarde cada imagen. Abre las imágenes en Fiyi. Para cada imagen, selecciona la herramienta Línea y dibuja una línea horizontal desde el centro del campo de visión hasta el centro de la hoja de luz. Para medir el desplazamiento, vaya a Analizar | Mide para ver la longitud de las líneas. A continuación, trace el desplazamiento de la lámina de luz en función de la profundidad de la muestra para calcular el ángulo de la lámina de luz por encima de O1. Traduce M1 ligeramente. Repita los pasos 4.9 y 4.10 hasta que el ángulo de la lámina de luz sea de 60° con respecto al eje óptico de O1, coincidiendo con el ángulo del plano de imagen. Figura 11: Imágenes de la cámara de la muestra de prueba de colorante fluorescente iluminada por una lámina de luz de forma correcta. (A) La hoja a 90°, recta hacia arriba a lo largo del eje óptico de O1, y (B) inclinada a 30° (60° al eje óptico de O1). Barras de escala = 50 μm. Abreviatura: O1 = objetivo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 12: Dirección correcta de la inclinación de la lámina de luz para alinearse con el plano de imagen de O1. Abreviatura: O1-O3 = objetivos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 5. Ajuste fino del sistema para la obtención de imágenes y la recopilación de datos Monta la diapositiva de cuentas 3D y traslada la muestra axialmente con la platina hasta que las cuentas llenen el campo de visión de la cámara. Ajuste el O3 utilizando la etapa xy y la etapa de traslación de la jaula, con el objetivo de minimizar las aberraciones y optimizar la relación señal-ruido en la imagen (Figura 13). Ajuste el collar de corrección de O1, con el objetivo de minimizar las aberraciones y optimizar la relación señal-ruido en la imagen. Figura 13: Imágenes de la cámara de la muestra de perlas 3D (perlas de 1 μm) iluminadas por una lámina de luz con la forma correcta. (A) Hoja a 90°, recta hacia arriba a lo largo del eje óptico de O1, y (B) inclinada a 30° con respecto al eje óptico de O1. El cuadro amarillo indica la parte del campo de visión que es plana, consistente y utilizable (80 μm x 80 μm) y en la que se pueden capturar datos fiables. Barras de escala = 50 μm. Abreviaturas: O1 = objetivo; FoV = campo de visión. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 6. Calibrar el aumento del sistema Monte el objetivo de prueba de rejilla positiva en la platina de muestra e ilumine con la luz de campo claro. Traslade la diapositiva de cuadrícula axialmente con el escenario para enfocar la diapositiva de cuadrícula. Enfoca el centro de la cuadrícula. Capture y guarde la imagen y, a continuación, ábrala en Fiyi. Utilice la herramienta Línea y la función Medir en Fiyi para medir con precisión la distancia entre dos líneas de cuadrícula en píxeles. Divida este valor por la distancia conocida (10 μm) para determinar la calibración de píxel a micra. Calcule el aumento (M) del sistema utilizando el tamaño medido del píxel y el tamaño conocido de un píxel con la ecuación (1).(1) 7. Adquisición de escaneos volumétricos Coloque la muestra.Encienda la vista previa de la cámara, el galvo, el generador de funciones, la fuente de alimentación, el escenario y el láser de excitación. Monte la muestra y, a continuación, haga clic en el botón FSK del generador de funciones para establecer una onda triangular. Para encontrar la muestra, utilice el generador de funciones para establecer lo siguiente: amplitud de pico a pico de 400 mV (con el botón Ampl.), desplazamiento de 0 (con el botón Offset ) y frecuencia de 200 mHz. Utilice la ventana de Micromanager para establecer un tiempo de exposición de 100 ms. Desplácese en z manualmente hasta alcanzar el plano de muestra. Optimice el ajuste z para que la región deseada para el escaneo volumétrico pase a través de la pantalla durante un ciclo. Seleccione los parámetros de escaneo.Asegúrese de que la amplitud de pico a pico esté configurada correctamente comprobando visualmente que la vista previa parece estar enfocada durante la exploración. Si la calidad de la imagen se degrada antes de acercarse a un extremo del escaneo que al otro, edite el desplazamiento en el generador de funciones para mover el centro del escaneo hacia la mejor región. En el programa Micromanager, seleccione un tiempo de exposición y haga clic en Multi-D Acq. para abrir la ventana Adquisición multidimensional. Utilice el cuadro Recuento para elegir el número de fotogramas, que establecerá el tiempo total de adquisición. El intervalo entre fotogramas (velocidad de fotogramas) se establecerá por el tiempo de exposición, a menos que se especifique un intervalo más largo en el cuadro Intervalo. En el generador de funciones, establezca la frecuencia para crear un escaneo de volumen completo por la mitad del período de la función de onda triangular (escaneo lineal en una dirección).NOTA: Si la velocidad de fotogramas y la frecuencia son demasiado bajas, se adquirirán muy pocos fotogramas para un escaneo de volumen, y el número bajo de fotogramas creará artefactos visibles en el posprocesamiento. Como referencia, la Figura 13 se componía de ~100 fotogramas en el escaneo y la Figura 14 se componía de ~800. También es fundamental tener en cuenta la propia muestra a la hora de seleccionar los parámetros. Asegúrese de que el tiempo de exposición esté ajustado de modo que la muestra esté lo suficientemente excitada pero no saturada. La intensidad del láser de excitación también se puede ajustar para este fin. Si el usuario está adquiriendo una serie de escaneos volumétricos para caracterizar un proceso variable en el tiempo en 3D, asegúrese de que la escala de tiempo de escaneo supere la dinámica de la escala de tiempo del sistema. Recopilación de vídeos: Adquiera un time-lapse que capture al menos la duración de una rampa completa hacia arriba o hacia abajo de la onda triangular, correspondiente a un escaneo completo del volumen. 8. Procedimientos de postratamiento Enderezamiento de pilas de imágenes volumétricasEnderezar los escaneos de volumen para convertir la pila de imágenes en planos inclinados en una serie de imágenes en coordenadas xyz reales.NOTA: Existen muchas guías excelentes sobre el posprocesamiento de imágenes de hoja de luz y software de código abierto para realizar el desviado de los escaneos de volumen existentes, así como para realizar el desviado y guardar las imágenes desviadas durante la adquisición24. Para enderezar los escaneos de volumen, obtenga los dos parámetros siguientes: la distancia real entre dos fotogramas en píxeles (d) y el ángulo entre el plano de fotogramas y el plano x-y (θ se establece mediante el ángulo de la lámina de luz oblicua (en este sistema, 30°). La distancia entre fotogramas dependerá de la óptica de imagen y de los ajustes de adquisición. Encontrar el parámetro dCalibra la distancia entre fotogramas cada vez que el sistema se realinea sustancialmente. Realice esta calibración con una pila de imágenes de perlas fluorescentes, ya que son las más fáciles de usar para diagnosticar problemas. Adquiera una pila de imágenes y ejecute el código de enderezamiento utilizando cualquier conjetura inicial para el parámetro d . Abra la pila de imágenes enderezadas en ImageJ y desplácese por la pila. Si d se ha establecido sustancialmente lejos de su valor real, observe que las cuentas aparecerán alargadas artificialmente en x o y, y las cuentas individuales parecerán moverse en el plano xy a medida que el usuario se desplaza por los marcos en z (en lugar de enfocar y desenfocar desde el mismo punto central). Itere sobre el parámetro d varias veces hasta que estos problemas ya no sean evidentes. Una vez que el parámetro d parezca estar razonablemente cerca del valor real, calcule las proyecciones de intensidad máxima de la pila de imágenes a lo largo de las direcciones x e y. Tenga en cuenta que las perlas de un diámetro cercano al límite de difracción pueden aparecer alargadas en z, pero lo ideal es que no parezcan cónicas ni alargadas en diagonal. Ajuste los parámetros de enderezamiento hasta que estos criterios no mejoren sustancialmente con nuevas iteraciones. Como referencia, los datos que se muestran en la Figura 13 se desviaron en d = 2,50 píxeles, y los datos de la Figura 14 se sesgaron en d = 1,0 píxeles.NOTA: La distancia entre fotogramas dependerá linealmente de la amplitud, la frecuencia y la velocidad de fotogramas de exploración.