Проектирование и создание настраиваемого однообъективного флуоресцентного микроскопа для визуализации сетей цитоскелета

1. Подготовка к выравниванию Прежде чем приступить к сборке, выполните все необходимые обзоры литературы, чтобы иметь четкое представление о предполагаемом варианте использования (например, флуорофоры, которые нужно визуализировать, необходимый объем изображения, требования к разрешению). В частности, обратитесь к разделу «Репрезентативные результаты» ниже, чтобы решить, уместно ли следовать точному описанному здесь дизайну. Если это так, перейдите к шагу 1.2. Если нет, ознакомьтесь с предложениями и рекомендациями по выбору оборудования в руководстве по сборке Sheunglab SOLS23.ПРИМЕЧАНИЕ: Пользователь может найти более подробную информацию о технических характеристиках этой конкретной системы в разделе обсуждения. Соберите все необходимые оптические, оптико-механические и электрические компоненты, как описано в таблице материалов. Для пользователей, модифицирующих систему, соберите все эквивалентные детали. Постройте юстировочный лазер, как показано на рисунке 2A. Убедитесь, что балка коллимирована с помощью срезной пластины. Постройте рамку для выравнивания диска из двойного матового стекла, как показано на рисунке 2B. Подготовьте испытуемый образец, покрытый флуоресцентным красителем.Создайте насыщенный раствор красителя родамина, постепенно добавляя 1 мл дистиллированной воды к 0,2 г лиофилизированного порошка до полного растворения. Вихрь для гомогенизации.ПРИМЕЧАНИЕ: Этот раствор является светочувствительным. Хотя во время приготовления нет необходимых мер предосторожности, убедитесь, что раствор хранится в темном месте после его приготовления.ВНИМАНИЕ: Всегда надевайте перчатки и маску при работе с порошком родамина. Наведите пипетку 10 мкл на центр предметного стекла. Поместите покровное стекло размером 22 мм x 22 мм поверх жидкости, следя за тем, чтобы слой флуоресценции был как можно тоньше. Запечатайте прозрачным лаком для ногтей.ПРИМЕЧАНИЕ: Этот образец чувствителен к свету. Чтобы максимально продлить срок службы образца, убедитесь, что предметное стекло хранится в темном месте, когда оно не используется. Подготовьте образец 3D-шарика (шарики размером 1 мкм, погруженные в гель).С помощью двустороннего скотча создайте вертикальный канал шириной 4-5 мм на образце слайда высотой в три слоя скотча. Поместите покровное стекло размером 22 мм x 22 мм поверх ленты в центре предметного стекла. Плотно надавите на участки с лентой, чтобы обеспечить хорошее прилегание между лентой и покровным стеклом. Используйте лезвие бритвы, чтобы удалить излишки ленты. Приготовьте 125 мл насыщенного раствора геллановой камеди, постепенно добавляя деионизированную воду к 1 г порошка геллановой камеди. Этот раствор будет твердым при комнатной температуре и жидким при 65 °C. Ввести 1 мл раствора геллановой камеди в микроцентрифужную пробирку. Нагрейте емкость с водой на горячей плите до 65 °C и нагревайте пробирку микроцентрифуги до тех пор, пока геллановая камедь не станет заметно вязкой. Приготовьте 10 мкл гранул в соотношении 1:1000 в подогретом растворе геллановой камеди. Осторожно пипеткой заведите раствор в камеру до полного заполнения. С помощью зубочистки нанесите небольшое количество эпоксидной смолы на обе стороны канала, полностью закрыв отверстия для герметизации. Чтобы обеспечить надлежащую герметизацию, визуально осмотрите оба конца, чтобы убедиться, что эпоксидная смола немного проникла в каждый конец канала. Рисунок 2: Фотографии инструментов для юстировки. (A) Коллимированный юстировочный лазер. AL1: Юстировочная линза 1, −50 мм; AL2: Юстировочная линза 2, 100 мм (B) Двойная матовая стеклянная рамка для юстировочного диска. Сокращения: RMS CP = RMS резьбовая сепараторная пластина; SM1 CP = пластина с резьбовым сепаратором SM1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка. 2. Выравнивание пути возбуждения Набросайте схему расположения микроскопа на поверхности оптического стола. Измерьте все расстояния как можно точнее.ПРИМЕЧАНИЕ: Расположение компонентов в системе показано на рисунке 3 . Установите возбуждающий лазер на стол. Установите две радужки на предполагаемую высоту лазера и установите их на расстоянии 2-3 футов друг от друга на желаемой линии отверстий позади местоположения зеркала 1 (M1). Используйте эти ирисы, чтобы убедиться, что луч находится на одном уровне с поверхностью стола и центрирован на линии отверстий на оптическом столе.ПРИМЕЧАНИЕ: Надевайте лазерные защитные очки для защиты глаз и блокируйте любые рассеянные лазерные лучи лазерными защитными экранами в качестве меры предосторожности. До тех пор, пока все компоненты не будут постоянно зажаты, возможен дрейф порядка часов. Устанавливайте радужную оболочку в самой дальней точке трассы в конце каждого дня для быстрой визуальной проверки дрейфа при возвращении к сборке. Вибрации, неправильно плавающий оптический стол и воздушные потоки являются наиболее распространенными причинами оптического дрейфа. Устанавливайте лазерный затвор как можно ближе к лазеру возбуждения. Используйте этот затвор для быстрой блокировки лазерного излучения во время юстировки, а не для многократного включения и выключения лазера. Соберите нейтральные фильтры в колесо нейтральных фильтров (ND 0.5, 1.0. 2.0, 3.0, 4.0 и пустой слот) и установите после лазерного затвора. Переключите привод с электроприводом на одну ступень перемещения (TS1), а затем вставьте ступень в положение M1. Убедитесь, что столик перемещается в осевом направлении вдоль той же линии отверстий, по которой проходит лазерный луч. Установите сцену в середине диапазона для первоначального размещения.На следующих шагах 2.6-2.10 вставляйте отражающие оптические компоненты в траекторию луча по одному, чтобы направить лазер по траектории, как показано на таблице. Используйте пару радужных оболочек, установленных на точную высоту, чтобы определить желаемую траекторию выходной балки и определить размещение и выравнивание каждого отражающего элемента. Для каждого элемента отрегулируйте высоту и положение крепления, чтобы входящий луч попадал в центр. Затем поверните основание крепления, чтобы направить луч вдоль вытянутой траектории луча на столе так, чтобы он проходил через обе диафрагмы, и точно отрегулируйте наклон исходящего луча с помощью ручек на задней части каждого крепления.ПРИМЕЧАНИЕ: После того, как каждый элемент будет выровнен по правильной высоте, добавьте накладной воротник к стойке, чтобы закрепить высоту. Установите и выровняйте M1 поверх TS1. Установите и выровняйте дихроика на столе. Следуя инструкциям производителя, подключите гальво к источнику питания и функциональному генератору. Установите гальво так, чтобы лазер падал точно по центру зеркала. Включите гальво, а затем нажмите и удерживайте кнопку AM на генераторе сигналов, чтобы установить наклон зеркала на ток 0 В постоянного тока (центр диапазона). Теперь выровняйте гальво по ирисам. Установите и выровняйте зеркало 2 (M2). Вставьте большое цилиндрическое зеркало в цилиндрическое крепление зеркала. Используйте стержни с сепаратором 1 дюйм, чтобы прикрепить адаптер сепаратора 30–60 мм над зеркалом 3 (M3). Используйте ручки на креплении зеркала, чтобы сгладить наклон зеркала M3 для первоначального размещения. Установите сепаратор для выравнивания двойного матового стекла в адаптер сепаратора над M3; Обязательно затяните установочные винты на адаптере сепаратора, которые удерживают сепаратор на месте, каждый раз, когда он используется для выравнивания. Установите M3 на стол и отрегулируйте высоту и положение до тех пор, пока балка не будет примерно отцентрирована на обоих выравнивающих дисках из матового стекла. Прикрепите M3 к столу и используйте крепление на стойке, 3 в стойке, зажим 90° и 2 в стойке с обеих сторон M3, чтобы добавить поддержку с помощью проклеенных отверстий по обе стороны крепления зеркала. Используйте ручки на задней части зеркала для точной регулировки луча.ПРИМЕЧАНИЕ: Все отражающие элементы на пути возбуждения теперь установлены и их нельзя трогать. Установите объектив 1 (L1) на стол. Для всех начальных установок объектива используйте навинчивающуюся мишень, чтобы центрировать входящий луч на передней части объектива. Отрегулируйте наклон и боковое положение объектива 1 (L1) до тех пор, пока луч не будет центрирован на обеих пластинах из матового стекла на юстировочной клетке над M3. Установите объектив 2 (L2) в соответствующее положение, чтобы создать систему 4f с L1. Переместите L2 в осевом направлении, чтобы получить коллимированный пучок, и используйте возбуждающий лазер и сдвиговую пластину, чтобы проверить коллимацию. Отрегулируйте наклон и боковое положение L2, чтобы центрировать луч на обоих дисках из матового стекла над M3. Установите отверстие в крепление для перемещения по оси XY. Установите его поверх стола 1D-перемещения, чтобы обеспечить точное осевое перемещение. Установите точечное отверстие и предметный столик на стойку и стойку крепления и поместите его в общую фокусную точку между L1 и L2. Отрегулируйте отверстие вручную до тех пор, пока лазерный свет не будет виден через отверстие. Установите датчик измерителя мощности сразу после отверстия и используйте кнопку длины волны на цифровой консоли измерителя мощности для выбора длины волны лазера возбуждения. Отрегулируйте положение отверстия по оси XY, чтобы максимизировать передачу и получить профиль луча, близкий к TEM00. Затем отрегулируйте точечное отверстие в осевом направлении с помощью 1D-столика, чтобы еще больше увеличить передачу. Установите объектив 4 (L4) на стол в нужном положении и отрегулируйте крепление на правильную высоту. Отрегулируйте L4 в осевом направлении так, чтобы луч возбуждения был сфокусирован на поверхности гальво. Отрегулируйте наклон и боковое положение L4, чтобы центрировать луч на обоих дисках из матового стекла над M3. Установите объектив 3 (L3) на стол в нужном положении и отрегулируйте крепление на правильную высоту. Используйте возбуждающий лазер и срезную пластину, чтобы проверить коллимацию L3 и L4. Отрегулируйте наклон и боковое положение L3, чтобы отцентрировать балку на обоих дисках из матового стекла над M3. Временно удалите L3. Установите сканирующую линзу 1 (SL1) на стол и отрегулируйте осевое расстояние, чтобы сформировать коллимированный телескоп с L4, измеренный с помощью сдвиговой пластины. Отрегулируйте наклон и боковое положение SL1, чтобы отцентрировать балку на обоих дисках из матового стекла над M3. Снова вставьте L3. Установите трубчатую линзу 1 (TL1) и используйте луч возбуждения и сдвиговую пластину для коллимации SL1 и TL1. Отрегулируйте наклон и боковое положение TL1, чтобы центрировать балку на обоих дисках из матового стекла над M3. С помощью переходного кольца вкрутите объектив 1 (O1) в пластину сепаратора над M3. Временно снимите SL1 и дайте балке коснуться потолка. Отрегулируйте высоту (осевое расстояние) O1 на системе сепаратора до тех пор, пока балка не образует диск Эйри на потолке, а затем продолжайте регулировку до тех пор, пока размер диска не будет сведен к минимуму. Установив O1 на место, установите предметный столик в соответствующее положение. Рисунок 3: Расположение компонентов в системе SOLS. (A) Принципиальная компоновка системы SOLS со всеми обозначенными компонентами. (B) Фотография физической системы SOLS сверху вниз на оптическом столе, за исключением области предметного столика. (C) Фотография сверху вниз области предметного столика (дополнение к рисунку 3B). Путь возбуждения показан зеленым цветом. Путь излучения показан красным цветом. Фокусные расстояния объективов: L1: 100 мм; L2: 45 мм; CL1: 50 мм; CL2: 200 мм; CL3: 100 мм; L3:150 мм; L4: 100 мм; SL1: 75 мм; TL1: 200 мм; SL2: 150 мм; TL2: 125 мм; TL3: 200 мм. Более подробные спецификации деталей см. в таблице материалов . Сокращения: SOLS = однообъективный световой лист; Колесо ND = колесо фильтра нейтральной плотности переменной плотности; L1-L4 = плоские вогнутые ахроматные линзы; CL1-CL3 = цилиндрические линзы; М1-М3 = зеркала; TS1-TS2 = этапы трансляции; DM = дихроичное зеркало; Galvo = сканирующий гальванометр; SL1-SL2 = сканирующие линзы; TL1-TL2 = трубчатые линзы; O1-O3 = цели; EF = фильтр выбросов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка. 3. Выравнивание траектории выбросов Настройте юстировочный лазер.Установите две пустые пластины сепаратора рядом с лазером возбуждения на той же высоте, что и лазер. Используйте эти сепараторные пластины для установки лазера юстировки, вставив стержни сепаратора лазера в пустые отверстия в двух пластинах сепаратора. Убедитесь, что лазер можно установить во включенное положение, либо заклеив скотчем кнопку питания, либо подключив переключатель включения/выключения. Извлеките O1 и снова вставьте выравнивающую клетку из матового стекла. Используйте одно кинематическое крепление зеркала и одно раскрывающееся зеркало, чтобы выровнять юстировочный луч по траектории луча возбуждения. Используйте измеритель мощности, чтобы максимизировать сигнал юстировочного луча после точечного отверстия путем точной регулировки двух зеркал. Убедитесь, что луч остается по центру матового стекла. Снимите выравнивающую клетку и снова вставьте O1. Поместите квадратное зеркало на предметный столик O1 и отрегулируйте зеркало в осевом направлении до тех пор, пока размер профиля луча не будет сведен к минимуму после дихроичности. Установите одну радужную оболочку на пути излучения и достаточно далеко назад, чтобы можно было без помех вставить сканирующую линзу 2 (SL2), тубусную линзу 2 (TL2) и объектив 2 (O2). Выровняйте эту радужную оболочку по юстировочному лазеру. Установите диск из матового стекла на расстоянии не менее 1 дюйма позади диафрагмы и убедитесь, что он также выровнен по лазерному свету. Вставьте SL2 на правильном расстоянии, измеренном от гальво с помощью линейки. Отрегулируйте наклон и боковое положение SL2 таким образом, чтобы входящий юстировочный луч был центрирован на SL2, а исходящий луч проходил через диафрагму и диск из матового стекла. Вставьте TL2 на правильном расстоянии, измеренном от SL2 с помощью линейки. Отрегулируйте наклон и боковое положение TL2 таким образом, чтобы входящий юстировочный луч был центрирован на TL2, а исходящий луч проходил через диафрагму и диск из матового стекла. Установите TS2 на стол. Убедитесь, что столик перемещается вдоль оптической оси O2. Прикрутите O2 к креплению для перемещения xy. Подсоедините стойку под креплением xy, чтобы установить O2 на предметный столик. Используйте навинчивающуюся мишень, чтобы центрировать заднюю часть O2 на красном лазере. Отрегулируйте ручки xy и наклон O2 так, чтобы красный луч проходила через диафрагму и диск из матового стекла. Переместите юстировочный лазер выше O1 и направьте вниз на траекторию излучения. Включите лазер и убедитесь, что этот луч центрирован на всех линзах на пути излучения. Соедините плоскости зрачков O1 и O2 , открыв радужную оболочку и удалив диск из матового стекла, чтобы юстировочный луч, выходящий из O2, продолжал беспрепятственно двигаться к удаленной поверхности или стене (>0,5 м) (рис. 4). Отрегулируйте TS2 до тех пор, пока луч не образует небольшой диск Эйри на поверхности, а затем продолжайте регулировку TS2, чтобы свести к минимуму размер диска Эйри.ПРИМЕЧАНИЕ: Сильно расходящийся луч указывает на неправильное размещение O2. Однако, поскольку этот луч проходит через две цели, ему присуща небольшая дивергенция. Таким образом, диск Эйри является лучшим проводником. Оптимизируйте гальво для наклонно-инвариантного сканирования: нажмите кнопку FSK на генераторе сигнала, чтобы выбрать сигнал треугольной волны для гальво, и установите низкую частоту (~1 Гц). Наблюдайте за выравнивающей балкой на той же удаленной поверхности или стене.ПРИМЕЧАНИЕ: Если гальво размещено неправильно, луч будет перемещаться горизонтально по поверхности вместе с движением гальво. Эта проблема может быть решена путем точной регулировки (вручную) наклона и положения по оси XY гальванического основания до тех пор, пока смещение луча не станет незаметным для глаз. Проверьте качество системы, получив изображение под углом 0°.Прикрутите O3 к креплению для перемещения xy. Вкрутите трубку объектива диаметром 1 дюйм в сепаратор переводного столика, а школьную ступень xy — в тубус. Используйте два стержня сепаратора, чтобы соединить переднюю часть ступени перемещения сепаратора с пластиной сепаратора и закрепить пластину сепаратора на стойке. Установите объектив 3 (O3) близко к передней части O2 (~4-5 мм) под углом 0° и отрегулируйте высоту в соответствии с ним. Установите юстировочный диск из матового стекла в общую фокальную плоскость между SL2 и TL2, измеренную линейкой. Установите акриловый флуоресцентный тестовый слайд на предметный стол и осветите его возбуждающим лазером. Посмотрите через заднюю часть O3, отрегулируйте высоту и осевое положение O3, чтобы найти излучающий свет, а затем отрегулируйте O3 в осевом направлении, пока свет излучения не заполнит заднее отверстие (рис. 5). Вкрутите два 8-дюймовых стержня сепаратора в заднюю часть передаточного столика O3. Наденьте пластину сепаратора с установленным диском из матового стекла на стержни, а затем точно отрегулируйте O3 с помощью крепления xy, чтобы убедиться, что свет излучения выходит из O3 по центру. Затем снимите стержни клетки. Установите диск из матового стекла в приблизительном положении датчика камеры и совместите высоту и положение диска с излучающим светом. Вкрутите линзу-трубку 3 (TL3) в пластину клетки и установите ее сразу за O3. Отцентрируйте TL3 на входящем светильнике, а затем отрегулируйте наклон TL3, чтобы выровнять исходящий свет по диску из матового стекла. Установите камеру на правильном расстоянии от объектива трубки, измеренном с помощью линейки. Прикрутите к камере 2-дюймовые тубусы объектива и эмиссионный фильтр. Установите юстировочный диск из матового стекла в общую фокальную плоскость между SL2 и TL2. Установите испытуемый образец флуоресцентного красителя и осветите образец возбуждающим лучом. Включите камеру, а затем откройте программу Micromanager на подключенном компьютере. Нажмите « В реальном времени », чтобы войти в режим живого просмотра. Нажмите « Авто один раз », чтобы установить начальные настройки экспозиции, а затем при необходимости сбросьте экспозицию при съемке.ПРИМЕЧАНИЕ: Микроменеджер не будет работать должным образом, если он не будет открыт после включения камеры. Отрегулируйте ручки перемещения xy на креплении O3 до тех пор, пока маленькое отверстие в регулировочном диске стекла не окажется по центру поля зрения (FoV). Отрегулируйте O3 в осевом направлении с помощью ступени перемещения сепаратора до тех пор, пока отверстие не окажется в фокусе; края должны получиться острыми (Рисунок 6). Изображение флуоресцентными шариками для проверки качества системы. Снимите юстировочный диск из матового стекла, установите образец 3D-шарика и осветите образец возбуждающим лучом. Регулируйте высоту образца относительно O1 до тех пор, пока флуоресцентные шарики не заполнят круглую область в центре поля зрения. Точно отрегулируйте положение O3 с помощью каскада xy и каскада осевого перемещения до тех пор, пока функции разброса точек (PSF) не станут круглыми (что указывает на минимальные аберрации) и яркими (что указывает на хорошее соотношение сигнал/шум) (рис. 7). Если этого нельзя достичь с помощью регулировки O3, весьма вероятно, что оптическая система между компонентами O1 и O2 выровнена неоптимально; Выполните диагностические проверки, описанные на шаге 3.13 ниже. Если удается получить круглые ПСФ , пропустите этап диагностики и переходите к наклону системы визуализации. При необходимости выполните диагностические проверки.ПРИМЕЧАНИЕ: После получения хороших PSF остальные этапы диагностики можно пропустить.Установите светлопольный источник света (BF) над O1. Установите контрольную мишень с положительной сеткой на предметном столике на той же осевой высоте, что и зеркало юстировки. Отцентрируйте сетку 10 мкм и осветите ее светом BF. Отобразите сетку на камере и преобразуйте образец до тех пор, пока сетка не окажется в фокусе. Используйте изображение сетки, чтобы убедиться, что поле поперек поля зрения плоское: в противном случае сетка будет выглядеть искаженной и изогнутой. Чтобы исправить неправильное изображение сетки, отрегулируйте положение и наклон Xyz O3, а затем соответствующим образом отрегулируйте TL3 и камеру.ПРИМЕЧАНИЕ: Если удается получить плоскую сетку, повторите шаг 3.12.10, а затем переходите к наклону системы визуализации. Установите юстировочную камеру или камеру изображения на правильном расстоянии, чтобы SL2 фокусировал изображение на датчике. Изобразите мишень сетки на промежуточной плоскости (рис. 8). Если эта сетка также перекошена, весьма вероятно, что оптическая система между компонентами O1 и SL2 неоптимально выровнена и должна быть пересмотрена. При необходимости оптимизируйте выравнивание, прежде чем двигаться дальше.ПРИМЕЧАНИЕ: Если камера не помещается между SL2 и TL2, используйте дополнительное зеркало, чтобы отразить изображение на 90° после SL2 и на камеру. Проверка PSF в промежуточной плоскости: После проверки сетки еще одной хорошей диагностической проверкой является проверка PSF в той же промежуточной плоскости. Хорошее изображение в этой плоскости, похожее на рисунок 7 , но при другом увеличении (рис. 9), указывает на хорошее выравнивание через SL2.ПРИМЕЧАНИЕ: Если в промежуточной плоскости можно получить плоскую сетку и круглые PSF, повторите шаг 3.13.2, затем шаг 3.12.10, а затем переходите к наклону системы визуализации. Наклоните подсистему обработки изображений O3 на 30°.Снимите O3, TL3 и камеру. Снова вставьте O3 под углом 30° к оптической оси O2, используя линии на столе в качестве ориентира. Установите юстировочный диск из матового стекла в общую фокальную плоскость между SL2 и TL2. Установите акриловый флуоресцентный тестовый слайд на предметный стол и осветите его возбуждающим лазером. Еще раз посмотрите через заднюю часть O3, отрегулируйте высоту и осевое положение O3, чтобы найти свет излучения под углом 30°, а затем отрегулируйте O3 в осевом направлении, пока свет излучения не заполнит заднее отверстие. Снимите юстировочный диск из матового стекла между SL2 и TL2, чтобы получить более сильный сигнал излучения. Вкрутите два 8-дюймовых стержня сепаратора в заднюю часть передаточного столика O3. Наденьте пластину сепаратора с установленным диском из матового стекла на стержни, а затем точно отрегулируйте O3 с помощью крепления xy, чтобы убедиться, что свет излучения выходит из O3 по центру. Затем снимите стержни клетки. Установите диск из матового стекла в приблизительном положении датчика камеры и совместите высоту и положение диска с излучающим светом. Установите TL3 сразу за O3. Отцентрируйте TL3 на входящем светильнике, а затем отрегулируйте наклон TL3, чтобы выровнять исходящий свет по диску из матового стекла. Для более точной установки расстояния до камеры TL3 осторожно открутите O3 и установите юстировочный лазер так, чтобы он фокусировался TL3 на камере. Используйте нейтральные фильтры по мере необходимости, чтобы интенсивность лазера составляла <1 мВт. Запустите просмотр камеры в реальном времени и отрегулируйте TL3 в осевом направлении, чтобы свести к минимуму лазерное пятно на камере. Установите юстировочный диск из матового стекла в общую фокальную плоскость между SL2 и TL2. Установите испытуемый образец флуоресцентного красителя и осветите образец возбуждающим лучом. Отрегулируйте ручки перемещения xy на креплении O3 до тех пор, пока маленькое отверстие в диске выравнивания стекла не окажется в поле зрения камеры. Отрегулируйте ступень перемещения сепаратора, чтобы перемещать O3 в осевом направлении до тех пор, пока отверстие не окажется в фокусе; Убедитесь, что отверстие выглядит так же, как и при 0°. Установите на место положительную контрольную мишень сетки на той же осевой высоте и осветите решетку светом BF. Убедитесь, что в фокусе находится только одна вертикальная секция (из-за наклона 30°). Опять же, используйте изображение сетки, чтобы убедиться, что поле напротив поля зрения плоское, даже если оно не в фокусе. Когда слайд перемещается в осевом направлении, убедитесь, что фокусированная часть поля зрения (цель сетки) проходит по экрану горизонтально, в то время как квадраты сетки сохраняют постоянный размер (рис. 10).ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за наклона плоскости изображения на образце сетка может казаться слегка растянутой в x-плоскости. Рисунок 4: Техника лазерного входа-лазера-выхода. Отправка коллимированного пробного пучка через переднюю часть O1 и наблюдение за лучом, выходящим из O2, на далекой поверхности. Если все компоненты выровнены на правильном расстоянии, луч образует небольшой диск Эйри на далекой поверхности. Все аббревиатуры такие же, как на рисунке 3. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 5: Использование излучения света для выравнивания. (A) Излучение света от акрилового флуоресцентного предметного стекла на навинчивающейся мишени за BFP O2. (B) Нахождение излучаемого света визуально через заднюю часть O3. Сокращения: O2-O3 = объективы; BFP = задняя фокальная плоскость. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 6: Изображение правильно сфокусированного юстировочного диска из матового стекла. Диск был помещен в промежуточную плоскость между SL2 и TL2. Масштабная линейка = 50 мкм. Сокращения: SL2 = сканирующий объектив; TL2 = трубчатая линза. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 7: Изображение с камеры образца 3D-валика. На изображении показаны шарики размером 1 нм с модулем визуализации, установленным на 0° и освещенные круговым лучом перед установкой цилиндрических линз. Масштабная линейка = 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 8: Тестовая мишень с положительной сеткой правильно сфокусирована в промежуточной плоскости между SL2 и TL2. Плоские сетки по всему полю указывают на хорошее выравнивание компонентов SL2 и предшествующих. Масштабная линейка = 30 мкм. Сокращения: SL2 = сканирующий объектив; TL2 = трубчатая линза. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 9: Изображение с камеры образца 3D-валика. На рисунке показаны бусины длиной 1 нм, правильно сфокусированные в промежуточной плоскости между SL2 и TL2. Масштабная линейка = 30 мкм. Сокращения: SL2 = сканирующий объектив; TL2 = трубчатая линза. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 10: Положительная тестовая мишень сетки с желтым квадратом одинакового размера, наложенным в соответствии с квадратами сетки. (A) Сетка в фокусе с левой стороны. (B) Сетка в фокусе с правой стороны. Желтый квадрат соответствует размеру прямоугольников сетки по обе стороны от поля зрения. Масштабные линейки = 30 мкм. Аббревиатура = FoV = поле зрения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка. 4. Выравнивание наклонного светового листа Снимите O1 и снова вставьте на свое место двойную матовую стеклянную выравнивающую клетку. Убедитесь, что луч коллимирован и центрирован на обоих дисках из матового стекла. Вкрутите цилиндрическую линзу 1 (CL1) во вращающийся байонет. Установите CL1 в оптический тракт и поверните его так, чтобы луч расширился в направлении вертикально к оптическому столу. Отрегулируйте наклон и боковое положение CL1 таким образом, чтобы балка была центрирована спереди и сохраняла центрированное положение на обоих дисках из матового стекла. Вкрутите цилиндрическую линзу 2 (CL2) во вращающийся байонет объектива и установите CL2 в оптический тракт на правильном расстоянии, чтобы сформировать систему 4f с CL1. Поверните CL2 в ту же ориентацию, что и CL1, так, чтобы луч растягивался в направлении вертикально к оптическому столу и коллимировался. Используйте контрольную карту для измерения высоты профиля цилиндрической балки в нескольких местах, чтобы убедиться, что балка коллимирована. Отрегулируйте наклон и боковое положение CL2, как показано в шаге 4.2. Вкрутите цилиндрическую линзу 3 (CL3) во вращающийся байонет объектива и установите CL3 в оптический тракт на правильном расстоянии, чтобы сформировать систему 4f с L3. Поверните CL3 в ту же ориентацию, что и CL1 и CL2, чтобы луч был сфокусирован вниз к горизонтальному профилю листа в фокальной плоскости. Отрегулируйте наклон и боковое положение CL3, как показано в шаге 4.2. Вставьте прорезь: Используя четыре 4-дюймовых стержня сепаратора и крепление клетки CL3, установите прорезь в вертикальной ориентации в фокальной плоскости между CL3 и L3, измеренной линейкой. Используйте растянутый профиль луча возбуждения, чтобы отрегулировать высоту и боковое положение щели до тех пор, пока она не будет центрирована на балке. Снова вставьте O1, установите тестовый образец флуоресцентного красителя и осветите образец световым листом возбуждения. На датчике камеры убедитесь, что световой лист с углом 0° выглядит как тонкий вертикальный лист (Рисунок 11A). Извлеките исследуемый образец флуоресцентного красителя и протрите O1 начисто. Пусть световой лист беспрепятственно расширяется над O1. Используя моторизованное управление ступенью перемещения, переместите M1 в сторону цилиндрических линз, чтобы установить угол светового полотна примерно 60° относительно оптической оси O1.ПРИМЕЧАНИЕ: Крайне важно, чтобы световой лист был наклонен в правильном направлении, чтобы выровняться с плоскостью изображения с аналогичным наклоном (Рисунок 12); Если система скомпонована иначе, чем эта конкретная конструкция, правильное направление наклона можно определить с помощью геометрической трассировки лучей.ПРИМЕЧАНИЕ: Для справки, переместив M1 на 2,647 мм в сторону прорези, установите световой лист на правильный наклон в этой настройке. Снова вставьте тестовый образец флуоресцентного красителя, чтобы получить изображение наклоненного листа. Убедитесь, что световой лист сохранил вертикальную форму луча на камере, но стал шире и слабее (Рисунок 11B). Переместите образец в осевом направлении с помощью стола таким образом, чтобы флуоресцентный краситель освещался световым полотном на пяти различных глубинах между центром поля зрения и правой стороной экрана. Сохраните каждое изображение. Откройте изображения на Фиджи. Для каждого изображения выберите инструмент «Линия» и нарисуйте горизонтальную линию от центра поля зрения до центра листа освещения. Чтобы измерить смещение, перейдите в раздел Анализ | Измерьте , чтобы увидеть длину линий. Затем постройте график смещения светового слоя в зависимости от глубины образца, чтобы вычислить угол светового листа над O1. Слегка переведите М1. Повторяйте шаги 4.9 и 4.10 до тех пор, пока угол светового листа не станет 60° от оптической оси O1, совпадая с углом плоскости изображения. Рисунок 11: Изображения с камеры испытуемого образца флуоресцентного красителя, освещенного световым слоем правильной формы. (А) Лист под углом 90°, прямо вверх вдоль оптической оси О1, и (Б) наклонен на 30° (60° к оптической оси О1). Масштабные линейки = 50 мкм. Аббревиатура: O1 = объектив. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка. Иллюстрация 12: Правильное направление наклона светового полотна для выравнивания с плоскостью изображения O1. Аббревиатура: О1-О3 = цели. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка. 5. Тонкая настройка системы визуализации и сбора данных Установите 3D-шарик и перемещайте образец в осевом направлении с помощью предметного столика до тех пор, пока шарики не заполнят поле зрения на камере. Отрегулируйте O3 с помощью каскада xy и каскада преобразования сепаратора, чтобы свести к минимуму аберрации и оптимизировать соотношение сигнал/шум на изображении (рис. 13). Отрегулируйте корректирующий воротник O1, чтобы свести к минимуму аберрации и оптимизировать соотношение сигнал/шум на изображении. Рисунок 13: Изображения с камеры образца 3D-шарика (шарики размером 1 мкм), освещенного световым слоем правильной формы. (A) Лист под углом 90° вверх вдоль оптической оси O1 и (B) наклонен на 30° к оптической оси O1. Желтым прямоугольником обозначена плоская, согласованная и пригодная для использования часть поля зрения (80 мкм x 80 мкм), в которой можно получить надежные данные. Масштабные линейки = 50 мкм. Сокращения: O1 = объектив; FoV = поле зрения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка. 6. Калибровка увеличения системы Установите тестовую мишень с положительной сеткой на предметный столик и осветите ее яркопольным светом. Переместите слайд сетки в осевом направлении вместе с рабочей областью, чтобы сфокусировать слайд сетки. Сфокусируйте центр сетки. Сделайте снимок и сохраните его, а затем откройте на Фиджи. Используйте инструмент «Линия » и функцию «Измерить » на Фиджи для точного измерения расстояния между двумя линиями сетки в пикселях. Разделите это значение на известное расстояние (10 мкм), чтобы определить калибровку от пикселя до микрона. Вычислите увеличение (M) системы, используя измеренный размер пикселя и известный размер пикселя с помощью уравнения (1).(1) 7. Получение объемных сканов Расположите образец.Включите предварительный просмотр камеры, гальво, генератор функций, источник питания, сцену и лазер возбуждения. Смонтируйте образец, а затем нажмите кнопку FSK на генераторе функций, чтобы задать треугольную волну. Чтобы найти выборку, используйте генератор функций, чтобы установить следующее: размах амплитуды 400 мВ (с помощью кнопки Ampl.), смещение 0 (с помощью кнопки Offset ) и частоту 200 мГц. Используйте окно Микроменеджер , чтобы установить время экспозиции 100 мс. Прокручивайте по оси Z вручную, пока не будет достигнута плоскость образца. Оптимизируйте настройку z таким образом, чтобы нужная область для объемного сканирования проходила через экран в течение одного цикла. Выберите параметры сканирования.Убедитесь, что амплитуда от пика до пика установлена правильно, визуально проверив, что предварительный просмотр находится в фокусе на протяжении всего сканирования. Если качество изображения ухудшается раньше, чем к одному концу сканирования, отредактируйте смещение в генераторе функций, чтобы переместить центр скана в лучшую область. В программе Micromanager выберите время экспозиции и нажмите Multi-D Acq. , чтобы открыть окно Multi-Dimensional Acquisition. Используйте поле Количество , чтобы выбрать количество кадров, которое будет задавать общее время сбора. Интервал между кадрами (частота кадров) будет задаваться временем экспозиции, если в поле «Интервал» не указан больший интервал. На генераторе функций установите частоту для создания полного объемного сканирования на половину периода функции треугольной волны (линейное сканирование в одном направлении).ПРИМЕЧАНИЕ: Если частота кадров и частота слишком низкие, для томного сканирования будет получено слишком мало кадров, а малое количество кадров создаст видимые артефакты при постобработке. Для справки, на рисунке 13 изображено ~100 кадров сканирования, а на рисунке 14 — ~ 800. Также очень важно учитывать саму пробу при выборе параметров. Убедитесь, что время экспозиции установлено таким образом, чтобы образец был достаточно возбужден, но не насыщен. С этой целью также можно регулировать интенсивность возбуждающего лазера. Если пользователь получает серию объемных сканов для характеристики изменяющегося во времени процесса в 3D, убедитесь, что шкала времени сканирования превышает динамику временной шкалы системы. Сбор видео: Получите интервальную съемку, которая фиксирует, по крайней мере, продолжительность полного нарастания или уменьшения треугольной волны, соответствующую одному полному сканированию громкости. 8. Процедуры постобработки Выравнивание стопок объемных изображенийВыровняйте объемные сканы, чтобы преобразовать стопку изображений в наклонных плоскостях в серию изображений в реальных координатах xyz.ПРИМЕЧАНИЕ: Существует множество отличных руководств по постобработке изображений светового листа и программному обеспечению с открытым исходным кодом для выполнения выравнивания существующих объемных сканов, а также для выполнения выравнивания и сохранения выровненных изображений во время съемки24. Для выравнивания объемных разверток необходимо получить два параметра: реальное расстояние между двумя кадрами в пикселях (d) и угол между плоскостью кадра и плоскостью x-y (θ задается углом наклонного светового листа (в этой системе 30°). Расстояние между кадрами будет зависеть от оптики изображения и настроек съемки. Нахождение параметра dОткалибруйте расстояние между кадрами каждый раз, когда система существенно перестраивается. Выполните эту калибровку со стопкой изображений флуоресцентных шариков, так как их проще всего использовать для диагностики проблем. Получите стопку изображений и запустите код выравнивания, используя любое начальное предположение для параметра d . Откройте подборку изображений с выравниванием в ImageJ и прокрутите ее. Если d было установлено значительно далеко от его истинного значения, обратите внимание, что бусины будут казаться искусственно вытянутыми по оси x или y, а отдельные бусины будут казаться движущимися в плоскости xy по мере того, как пользователь прокручивает кадры в z (вместо фокусировки и расфокусировки от одной и той же центральной точки). Перебирайте параметр d несколько раз, пока эти проблемы не исчезнут. Как только параметр d окажется достаточно близким к истинному значению, вычислите проекции максимальной интенсивности стека изображений по направлениям x и y. Обратите внимание, что шарики диаметра, близкого к дифракционному пределу, могут казаться вытянутыми по оси z, но в идеале они не должны казаться коническими или вытянутыми по диагонали. Выполняйте тонкую настройку параметров выравнивания до тех пор, пока эти критерии существенно не улучшатся с новыми итерациями. Для справки, данные, показанные на рисунке 13 , были перекошены при d = 2,50 пикселя, а данные на рисунке 14 — при d = 1,0 пикселя.ПРИМЕЧАНИЕ: Расстояние между кадрами будет линейно зависеть от амплитуды, частоты и частоты кадров сканирования.