In Vitro G-Quadruplex DNA Yapılarının Bis-3-Kloropiperidinler ile Kimyasal Haritalanması
Summary
Bis-3-kloropipiperidinler (B-CeP’ler), in vitro DNA şablonlarındaki G-dörtlü yapıları tanımlamak ve karakterize etmek için yararlı kimyasal problardır. Bu protokol, B-CeP’ler ile sondalama reaksiyonları gerçekleştirme ve reaksiyon ürünlerini yüksek çözünürlüklü poliakrilamid jel elektroforezi ile çözme prosedürünü detaylandırır.
Abstract
G-dörtlüleri (G4’ler), gen ekspresyonu ve hastalıklarda önemli bir rol oynayan ve önemli terapötik hedefleri temsil eden, biyolojik olarak ilgili, kanonik olmayan DNA yapılarıdır. Potansiyel G-dörtlü oluşturan diziler (PQS’ler) içinde DNA’nın in vitro karakterizasyonu için erişilebilir yöntemler gereklidir. B-CeP’ler, nükleik asitlerin yüksek dereceli yapısının araştırılması için yararlı kimyasal problar olduğu kanıtlanmış bir alkilleyici ajan sınıfıdır. Bu makale, guaninlerin N7’si ile B-CeP’lerin spesifik reaktivitesinden yararlanan yeni bir kimyasal haritalama testini ve ardından alkillenmiş Gs’de doğrudan iplik bölünmesini açıklamaktadır.
Yani, G4 kıvrımlarını katlanmamış DNA formlarından ayırt etmek için, G4 düzenlemesini üstlenebilen 15-mer’lik bir DNA olan trombin bağlayıcı aptameri (TBA) araştırmak için B-CeP 1’i kullanıyoruz. B-CeP’ye yanıt veren guaninlerin B-CeP 1 ile reaksiyonu, alkillenmiş guaninlerde tek tek alkilasyon eklentilerini ve DNA zinciri bölünmesini bularak tek nükleotid seviyesinde yüksek çözünürlüklü poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE) ile çözülebilen ürünler verir. B-CeP’leri kullanarak haritalama, G-dörtlü oluşturan DNA dizilerinin in vitro karakterizasyonu için basit ve güçlü bir araçtır ve G-tetradların oluşumunda yer alan guaninlerin kesin konumunu sağlar.
Introduction
Tipik Watson-Crick çift sarmalına ek olarak, nükleik asitler, guanin açısından zengin dizileri nedeniyle alternatif G-dörtlü (G4) formu gibi çeşitli ikincil yapıları benimseyebilir. G4 yapısı, dört guaninin Hoogsteen hidrojen bağları yoluyla etkileşime girdiği G-tetradlar adı verilen düzlemsel tetramerlerin oluşumuna dayanır. G-tetradlar, guanin çekirdeğinin merkezinde koordine edilen monovalent katyonlarla istiflenir ve daha da stabilize edilir (Şekil 1)1.
Şekil 1: G-dörtlü yapısının şematik gösterimi. (A) Bir G-tetradının şematik gösterimi. Düzlemsel dizi, Hoogsteen baz eşleşmesi ve merkezi bir katyon (M+) ile stabilize edilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
En az iki ardışık guanin nükleotidinin dört veya daha fazla çalışmasına sahip diziler, G-dörtlü yapılarda katlanabilen potansiyel G-dörtlü oluşturan dizilerdir (PQS’ler). PQS’ler, telomerler, gen promotörleri, ribozomal DNA ve rekombinasyon bölgeleri gibi birçok farklı hücresel bağlamda bulunur ve birçok biyolojik sürecin düzenlenmesinde rol oynar2. Bu nedenle, şu anda esas olarak hesaplama araçları aracılığıyla gerçekleştirilen insan genomundaki G4’lerin tanımlanması ve deneysel olarak doğrulanması, biyolojik olarak ilgili bir konudur3. Hesaplamalı tahminleri desteklemek veya öngörülemeyen G4 yapılarını tespit etmek için, bir DNA şablonundaki G4 oluşumunu tanımlamak için kimyasal haritalamaya dayalı erişilebilir bir yöntem burada gösterilmektedir ve G-tetrad yapısını oluşturan guaninlerin kesin olarak tanımlanmasını sağlar.
Rapor edilen kimyasal haritalama testi, G4 yapılarının oluşumunu takiben bis-3-kloropiperidinlerin (B-CeP’ler) guaninlerle farklı reaktivitesinden yararlanır. Nükleofiller 4,5,6,7,8,9 ile yüksek reaktiviteleri nedeniyle, B-CeP’ler, guanin nükleotidlerinin10 N7konumu ile çok verimli bir şekilde reaksiyona girme kabiliyetine sahip nükleik asit-alkilleyici ajanlardır. Alkilasyonu, tek ve çift sarmallı DNA yapılarında depurinasyon ve iplik bölünmesi takip eder. Aksine, G4 düzenlemelerinde G-tetradların oluşumunda yer alan guaninler, guaninlerin N7konumu Hoogsteen hidrojen bağlarında rol oynadığından, B-CeP alkilasyonuna karşı geçirimsizdir. B-CeP’lerin bu spesifik reaktivitesi, yalnızca G4 yapılarının saptanmasına değil, aynı zamanda tetrad(lar)ı oluşturan guaninlerin tanımlanmasına da izin verir, çünkü bunlar, tek ve çift sarmallı DNA’daki guaninlere kıyasla alkilasyondan göreceli korumalarından çıkarılabilir.
Kimyasal haritalama protokolü burada, potasyum katyonları 11,12 varlığında G4 düzenlemesini üstlenebilen bir 15-mer DNA olan trombin bağlayıcı aptamerin (TBA) karakterizasyonu için bir prob olarak B-CeP 1 (Şekil 2A) kullanılarak rapor edilmiştir. TBA’nın G4 düzenlemesi (G4-TBA), tek sarmallı formda TBA (ssTBA) ve çift sarmallı yapıyı (dsTBA) oluşturmak için tamamlayıcı dizisine tavlanmış TBA olmak üzere iki kontrol ile doğrudan karşılaştırılır (Tablo 1). Sondalama reaksiyonlarının ürünleri, alkillenmiş guaninlerde tek tek alkilasyon eklentilerini ve DNA zinciri bölünmesini bularak tek nükleotid seviyesinde yüksek çözünürlüklü poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE) ile çözülür. Jel üzerinde görselleştirme, TBA oligonükleotidinin 3′ ucunda bir florofor ile konjugasyonu ile sağlanır (Tablo 1). Bu protokol, TBA’nın farklı konformasyonlarında (G4 ve kontroller) nasıl katlanacağını ve B-CeP’ler ve ardından PAGE ile sondalama reaksiyonlarının nasıl gerçekleştirileceğini gösterir.
Protocol
Representative Results
Discussion
G-dörtlüleri, tipik olarak guanin açısından zengin DNA dizileri içinde katlanan nükleik asit ikincil yapılarıdır ve genetik kontrol ve hastalıklarla ilişkileri nedeniyle önemli araştırma hedefleridir. B-CeP’ler ile kimyasal haritalama, fizyolojik tuz koşulları altında G-tetradların oluşumunda rol oynayan guanin bazlarını tanımlamak için kullanılabilen DNA G4’lerin karakterizasyonu için yararlı bir protokoldür.
Bu protokolde kullanılan kimyasal prob, guanin nükleob…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Padova Üniversitesi Farmasötik ve Farmakolojik Bilimler Bölümü (PRIDJ-BIRD2019) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Acrylamide/bis-acrylamide solution 40% | Applichem | A3658 | R45-46-20/21-25-36/38-43-48/23/ 24/25-62 |
| Ammonium per-sulfate (APS) | Sigma Aldrich | A7460 | |
| Analytical balance | Mettler Toledo | ||
| Autoclave | pbi international | ||
| Boric acid | Sigma Aldrich | B0252 | |
| Bromophenol blue Brilliant blue R | Sigma Aldrich | B0149 | |
| di-Sodium hydrogen phosphate dodecahydrate | Fluka | 71649 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | 276855 | |
| DNA oligonucleotides | Integrated DNA Technologies | synthesis of custom sequences | |
| EDTA disodium | Sigma Aldrich | E5134 | |
| Formamide | Fluka | 40248 | H351-360D-373 |
| Gel imager | GE Healtcare | STORM B40 | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G5516 | |
| Micro tubes 0.5 mL | Sarstedt | 72.704 | |
| Potassium Chloride | Sigma Aldrich | P9541 | |
| Sequencing apparatus | Biometra | Model S2 | |
| Silanization solution I | Fluka | 85126 | H225, 314, 318, 336, 304, 400, 410 |
| Sodium phosphate monobasic | Carlo Erba | 480086 | |
| Speedvac concentrator | Thermo Scientific | Savant DNA 120 | |
| TEMED | Fluka | 87689 | R11-21/22-23-34 |
| Tris-HCl | MERCK | 1.08387.2500 | |
| Urea | Sigma Aldrich | 51456 | |
| UV-Vis spectrophotometer | Thermo Scientific | Nanodrop 1000 |
References
- Davis, J. T. G-quartets 40 years later: from 5′-GMP to molecular biology and supramolecular chemistry. Angewandte Chemie. 43 (6), 668-698 (2004).
- Varshney, D., Spiegel, J., Zyner, K., Tannahill, D., Balasubramanian, S. The regulation and functions of DNA and RNA G-quadruplexes. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (8), 459-474 (2020).
- Chambers, V. S., et al. High-throughput sequencing of DNA G-quadruplex structures in the human genome. Nature Biotechnology. 33 (8), 877-881 (2015).
- Zuravka, I., Sosic, A., Gatto, B., Gottlich, R. Synthesis and evaluation of a bis-3-chloropiperidine derivative incorporating an anthraquinone pharmacophore. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 25 (20), 4606-4609 (2015).
- Zuravka, I., Roesmann, R., Sosic, A., Gottlich, R., Gatto, B. Bis-3-chloropiperidines containing bridging lysine linkers: Influence of side chain structure on DNA alkylating activity. Bioorganic & Medicinal Chemistry. 23 (6), 1241-1250 (2015).
- Zuravka, I., et al. Synthesis and DNA cleavage activity of bis-3-chloropiperidines as alkylating agents. ChemMedChem. 9 (9), 2178-2185 (2014).
- Sosic, A., Gottlich, R., Fabris, D., Gatto, B. B-CePs as cross-linking probes for the investigation of RNA higher-order structure. Nucleic Acids Research. 49 (12), 6660-6672 (2021).
- Sosic, A., et al. Bis-3-chloropiperidines targeting TAR RNA as a novel strategy to impair the HIV-1 nucleocapsid protein. Molecules. 26 (7), 1874 (2021).
- Sosic, A., et al. In vitro evaluation of bis-3-chloropiperidines as RNA modulators targeting TAR and TAR-protein interaction. International Journal of Molecular Sciences. 23 (2), 582 (2022).
- Sosic, A., et al. Direct and topoisomerase II mediated DNA damage by bis-3-chloropiperidines: The importance of being an earnest G. ChemMedChem. 12 (17), 1471-1479 (2017).
- Bock, L. C., Griffin, L. C., Latham, J. A., Vermaas, E. H., Toole, J. J. Selection of single-stranded DNA molecules that bind and inhibit human thrombin. Nature. 355 (6360), 564-566 (1992).
- Paborsky, L. R., McCurdy, S. N., Griffin, L. C., Toole, J. J., Leung, L. L. The single-stranded DNA aptamer-binding site of human thrombin. The Journal of Biological Chemistry. 268 (28), 20808-20811 (1993).
- Carraro, C., et al. Behind the mirror: chirality tunes the reactivity and cytotoxicity of chloropiperidines as potential anticancer agents. ACS Medicinal Chemistry Letters. 10 (4), 552-557 (2019).
- Carraro, C., et al. Appended aromatic moieties in flexible bis-3-chloropiperidines confer tropism against pancreatic cancer cells. ChemMedChem. 16 (5), 860-868 (2021).
- Kypr, J., Kejnovska, I., Renciuk, D., Vorlickova, M. Circular dichroism and conformational polymorphism of DNA. Nucleic Acids Research. 37 (6), 1713-1725 (2009).
- Onel, B., Wu, G., Sun, D., Lin, C., Yang, D. Electrophoretic mobility shift assay and dimethyl sulfate footprinting for characterization of G-quadruplexes and G-quadruplex-protein complexes. Methods in Molecular Biology. 2035, 201-222 (2019).
