في المختبر رسم الخرائط الكيميائية لهياكل الحمض النووي G-quadruplex بواسطة Bis-3-chloropiperidines
Summary
Bis-3-chloropiperidines (B-CePs) هي مجسات كيميائية مفيدة لتحديد وتوصيف هياكل G-quadruplex في قوالب الحمض النووي في المختبر. يفصل هذا البروتوكول الإجراء الخاص بإجراء تفاعلات التحقيق مع B-CePs وحل منتجات التفاعل عن طريق الرحلان الكهربائي عالي الدقة لهلام بولي أكريلاميد عالي الدقة.
Abstract
G-quadruplexes (G4s) هي هياكل الحمض النووي غير المتعارف عليها بيولوجيا والتي تلعب دورا مهما في التعبير الجيني والأمراض ، وتمثل أهدافا علاجية مهمة. هناك حاجة إلى طرق يمكن الوصول إليها لتوصيف الحمض النووي في المختبر ضمن تسلسلات تشكيل G-quadruplex المحتملة (PQSs). B-CePs هي فئة من عوامل الألكلة التي أثبتت أنها مجسات كيميائية مفيدة للتحقيق في البنية ذات الترتيب الأعلى للأحماض النووية. تصف هذه الورقة مقايسة رسم خرائط كيميائية جديدة تستغل التفاعل النوعي ل B-CePs مع N7 من الجوانين ، متبوعا بالانقسام المباشر في Gs الألكيلية.
وبالتحديد ، لتمييز طيات G4 عن أشكال الحمض النووي غير المطوية ، نستخدم B-CeP 1 لفحص أبتامير المرتبط بالثرومبين (TBA) ، وهو حمض نووي 15 مير قادر على تحمل ترتيب G4. ينتج عن تفاعل الجوانين المستجيب ل B-CeP مع B-CeP 1 منتجات يمكن حلها عن طريق الرحلان الكهربائي عالي الدقة لهلام بولي أكريلاميد (PAGE) على مستوى نيوكليوتيد واحد عن طريق تحديد موقع مقرب الألكلة الفردي وانقسام حبلا الحمض النووي في الجوانين الألكيل. يعد رسم الخرائط باستخدام B-CePs أداة بسيطة وقوية للتوصيف المختبري لتسلسلات الحمض النووي المكونة ل G-quadruplex ، مما يتيح تحديد الموقع الدقيق للجوانين المشاركة في تكوين G-tetrads.
Introduction
بالإضافة إلى الحلزون المزدوج النموذجي Watson-Crick ، يمكن للأحماض النووية اعتماد هياكل ثانوية مختلفة ، مثل الشكل البديل G-quadruplex (G4) ، بسبب تسلسلاتها الغنية بالجوانين. يعتمد هيكل G4 على تكوين رباعيات مستوية ، تسمى G-tetrades ، حيث تتفاعل أربعة جوانين من خلال روابط هيدروجينية Hoogsteen. يتم تكديس G-tetrads وتثبيتها بشكل أكبر بواسطة الكاتيونات أحادية التكافؤ التي يتم تنسيقها في وسط قلب الجوانين (الشكل 1)1.
الشكل 1: تمثيل تخطيطي لهيكل G-quadruplex. (أ) تمثيل تخطيطي لرباعي G. يتم تثبيت الصفيف المستوي بواسطة اقتران قاعدة Hoogsteen وبواسطة كاتيون مركزي (M +). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
التسلسلات التي تحتوي على أربعة أشواط أو أكثر من نيوكليوتيدات الجوانين المتتالية على الأقل هي تسلسلات محتملة لتشكيل G-quadruplex (PQSs) يمكن طيها في هياكل G-quadruplex. توجد PQSs في العديد من السياقات الخلوية المختلفة ، مثل التيلوميرات ، ومروجات الجينات ، والحمض النووي الريبوسومي ، ومواقع إعادة التركيب ، وتشارك في تنظيم العديد من العمليات البيولوجية2. ومن ثم، فإن تحديد G4s والتحقق التجريبي من صحتها في الجينوم البشري، والذي يتم إجراؤه حاليا في المقام الأول من خلال الأدوات الحسابية، هو قضية ذات صلة بيولوجية3. من أجل دعم التنبؤات الحسابية أو الكشف عن هياكل G4 غير المتوقعة ، يتم عرض طريقة يمكن الوصول إليها تعتمد على رسم الخرائط الكيميائية لتحديد تكوين G4 في قالب الحمض النووي هنا ، مما يتيح التحديد الدقيق للجوانين التي تشكل بنية G-tetrad.
يستغل اختبار رسم الخرائط الكيميائية المبلغ عنه التفاعل المختلف لثنائي 3-كلوروبيريدين (B-CePs) مع الجوانين بعد تكوين هياكل G4. نظرا لتفاعلها العالي مع النيوكليوفيليات4،5،6،7،8،9 ، فإن B-CePs هي عوامل ألكلة الحمض النووي مع القدرة على التفاعل بكفاءة عالية مع موضع N7 من نيوكليوتيدات الجوانين10. يتبع الألكلة التطهير والانقسام الخيطي في تركيبات الحمض النووي المفردة والمزدوجة الشريط. على العكس من ذلك ، فإن الجوانين المشاركة في تكوين G-tetrads في ترتيبات G4 منيعة على ألكلة B-CeP ، حيث أن موضع N7 من الجوانين متورط في روابط Hoogsteen الهيدروجينية. لا يسمح هذا التفاعل المحدد ل B-CePs باكتشاف هياكل G4 فحسب ، بل يسمح أيضا بتحديد الجوانين التي تشكل رباعي (رباعيات) ، حيث يمكن استنتاجها من حمايتها النسبية من الألكلة مقارنة بالجوانين في الحمض النووي أحادي ومزدوج الشريط.
تم الإبلاغ عن بروتوكول رسم الخرائط الكيميائية هنا باستخدام B-CeP 1 (الشكل 2A) كمسبار لتوصيف أبتامير المرتبط بالثرومبين (TBA) ، وهو حمض نووي 15-mer قادر على افتراض ترتيب G4 في وجود كاتيونات البوتاسيوم11,12. تتم مقارنة ترتيب G4 ل TBA (G4-TBA) مباشرة مع اثنين من عناصر التحكم ، وهما TBA في الشكل أحادي الشريط (ssTBA) و TBA الملدن إلى تسلسله التكميلي لتشكيل البناء المزدوج الذي تقطعت به السبل (dsTBA) (الجدول 1). يتم حل نواتج تفاعلات الفحص عن طريق الرحلان الكهربائي عالي الدقة لهلام بولي أكريلاميد (PAGE) على مستوى النوكليوتيدات المفردة عن طريق تحديد موقع مضافات الألكلة الفردية وانقسام حبلا الحمض النووي عند الجوانين الألكيل. يتم تمكين التصور على الجل عن طريق اقتران قليل النوكليوتيد TBA مع فلوروفور في نهايته 3′-end (الجدول 1). يوضح هذا البروتوكول كيفية طي TBA في مطابقاته المختلفة (G4 وعناصر التحكم) ، وكيفية إجراء تفاعلات التحقيق مع B-CePs متبوعة ب PAGE.
Protocol
Representative Results
Discussion
G-quadruplexes هي هياكل ثانوية للحمض النووي تطوى عادة داخل تسلسل الحمض النووي الغني بالجوانين ، وهي أهداف بحثية مهمة بسبب ارتباطها بالتحكم الجيني والأمراض. يعد رسم الخرائط الكيميائية بواسطة B-CePs بروتوكولا مفيدا لتوصيف الحمض النووي G4s ، والذي يمكن استخدامه لتحديد قواعد الجوانين المشاركة في تكوي?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل قسم العلوم الصيدلانية والدوائية ، جامعة بادوفا (PRIDJ-BIRD2019).
Materials
| Acrylamide/bis-acrylamide solution 40% | Applichem | A3658 | R45-46-20/21-25-36/38-43-48/23/ 24/25-62 |
| Ammonium per-sulfate (APS) | Sigma Aldrich | A7460 | |
| Analytical balance | Mettler Toledo | ||
| Autoclave | pbi international | ||
| Boric acid | Sigma Aldrich | B0252 | |
| Bromophenol blue Brilliant blue R | Sigma Aldrich | B0149 | |
| di-Sodium hydrogen phosphate dodecahydrate | Fluka | 71649 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | 276855 | |
| DNA oligonucleotides | Integrated DNA Technologies | synthesis of custom sequences | |
| EDTA disodium | Sigma Aldrich | E5134 | |
| Formamide | Fluka | 40248 | H351-360D-373 |
| Gel imager | GE Healtcare | STORM B40 | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G5516 | |
| Micro tubes 0.5 mL | Sarstedt | 72.704 | |
| Potassium Chloride | Sigma Aldrich | P9541 | |
| Sequencing apparatus | Biometra | Model S2 | |
| Silanization solution I | Fluka | 85126 | H225, 314, 318, 336, 304, 400, 410 |
| Sodium phosphate monobasic | Carlo Erba | 480086 | |
| Speedvac concentrator | Thermo Scientific | Savant DNA 120 | |
| TEMED | Fluka | 87689 | R11-21/22-23-34 |
| Tris-HCl | MERCK | 1.08387.2500 | |
| Urea | Sigma Aldrich | 51456 | |
| UV-Vis spectrophotometer | Thermo Scientific | Nanodrop 1000 |
References
- Davis, J. T. G-quartets 40 years later: from 5′-GMP to molecular biology and supramolecular chemistry. Angewandte Chemie. 43 (6), 668-698 (2004).
- Varshney, D., Spiegel, J., Zyner, K., Tannahill, D., Balasubramanian, S. The regulation and functions of DNA and RNA G-quadruplexes. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (8), 459-474 (2020).
- Chambers, V. S., et al. High-throughput sequencing of DNA G-quadruplex structures in the human genome. Nature Biotechnology. 33 (8), 877-881 (2015).
- Zuravka, I., Sosic, A., Gatto, B., Gottlich, R. Synthesis and evaluation of a bis-3-chloropiperidine derivative incorporating an anthraquinone pharmacophore. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 25 (20), 4606-4609 (2015).
- Zuravka, I., Roesmann, R., Sosic, A., Gottlich, R., Gatto, B. Bis-3-chloropiperidines containing bridging lysine linkers: Influence of side chain structure on DNA alkylating activity. Bioorganic & Medicinal Chemistry. 23 (6), 1241-1250 (2015).
- Zuravka, I., et al. Synthesis and DNA cleavage activity of bis-3-chloropiperidines as alkylating agents. ChemMedChem. 9 (9), 2178-2185 (2014).
- Sosic, A., Gottlich, R., Fabris, D., Gatto, B. B-CePs as cross-linking probes for the investigation of RNA higher-order structure. Nucleic Acids Research. 49 (12), 6660-6672 (2021).
- Sosic, A., et al. Bis-3-chloropiperidines targeting TAR RNA as a novel strategy to impair the HIV-1 nucleocapsid protein. Molecules. 26 (7), 1874 (2021).
- Sosic, A., et al. In vitro evaluation of bis-3-chloropiperidines as RNA modulators targeting TAR and TAR-protein interaction. International Journal of Molecular Sciences. 23 (2), 582 (2022).
- Sosic, A., et al. Direct and topoisomerase II mediated DNA damage by bis-3-chloropiperidines: The importance of being an earnest G. ChemMedChem. 12 (17), 1471-1479 (2017).
- Bock, L. C., Griffin, L. C., Latham, J. A., Vermaas, E. H., Toole, J. J. Selection of single-stranded DNA molecules that bind and inhibit human thrombin. Nature. 355 (6360), 564-566 (1992).
- Paborsky, L. R., McCurdy, S. N., Griffin, L. C., Toole, J. J., Leung, L. L. The single-stranded DNA aptamer-binding site of human thrombin. The Journal of Biological Chemistry. 268 (28), 20808-20811 (1993).
- Carraro, C., et al. Behind the mirror: chirality tunes the reactivity and cytotoxicity of chloropiperidines as potential anticancer agents. ACS Medicinal Chemistry Letters. 10 (4), 552-557 (2019).
- Carraro, C., et al. Appended aromatic moieties in flexible bis-3-chloropiperidines confer tropism against pancreatic cancer cells. ChemMedChem. 16 (5), 860-868 (2021).
- Kypr, J., Kejnovska, I., Renciuk, D., Vorlickova, M. Circular dichroism and conformational polymorphism of DNA. Nucleic Acids Research. 37 (6), 1713-1725 (2009).
- Onel, B., Wu, G., Sun, D., Lin, C., Yang, D. Electrophoretic mobility shift assay and dimethyl sulfate footprinting for characterization of G-quadruplexes and G-quadruplex-protein complexes. Methods in Molecular Biology. 2035, 201-222 (2019).
