In vitro Mappatura chimica delle strutture del DNA G-quadruplex mediante bis-3-cloroperidine

Oltre alla tipica doppia elica di Watson-Crick, gli acidi nucleici possono adottare varie strutture secondarie, come la forma alternativa G-quadruplex (G4), a causa delle loro sequenze ricche di guanina. La struttura G4 si basa sulla formazione di tetrameri planari, chiamati G-tetrade, in cui quattro guanine interagiscono attraverso legami idrogeno di Hoogsteen. Le G-tetradi sono impilate e ulteriormente stabilizzate da cationi monovalenti coordinati al centro del nucleo guaninico (Figura 1)¹.

Figura 1: Rappresentazione schematica di una struttura G-quadruplex. (A) Rappresentazione schematica di una G-tetrade. L’array planare è stabilizzato dall’appaiamento di basi di Hoogsteen e da un catione centrale (M⁺). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Le sequenze con quattro o più cicli di almeno due nucleotidi guanina consecutivi sono potenziali sequenze formanti G-quadruplex (PQS) che possono ripiegarsi in strutture G-quadruplex. Le PQS sono localizzate in molti contesti cellulari diversi, come i telomeri, i promotori genici, il DNA ribosomiale e i siti di ricombinazione, e sono coinvolte nella regolazione di molti processi biologici². Quindi, l’identificazione e la validazione sperimentale di G4 nel genoma umano, che attualmente viene eseguita principalmente attraverso strumenti computazionali, è una questione biologicamente rilevante³. Al fine di supportare le previsioni computazionali o rilevare strutture G4 non previste, viene mostrato un metodo accessibile basato sulla mappatura chimica per identificare la formazione di G4 in un modello di DNA, che consente l’identificazione precisa delle guanine che formano la struttura G-tetrade.

Il saggio di mappatura chimica riportato sfrutta la diversa reattività delle bis-3-cloropiperidine (B-CePs) con le guanine in seguito alla formazione di strutture G4. A causa della loro elevata reattività con i nucleofili 4,5,6,7,8,9^, i B-CeP sono agenti alchilanti dell’acido nucleico con la capacità di reagire in modo molto efficiente con la posizione N7 dei nucleotidi guanina¹⁰. L’alchilazione è seguita dalla depurazione e dalla scissione del filamento nei costrutti di DNA a singolo e doppio filamento. Al contrario, le guaine coinvolte nella formazione delle G-tetradi nelle disposizioni G4 sono impermeabili all’alchilazione B-CeP, poiché la posizione N7 delle guanine è implicata nei legami idrogeno di Hoogsteen. Questa specifica reattività dei B-CeP permette non solo la rilevazione delle strutture G4, ma anche l’identificazione delle guanine che formano la/e tetrade/e, come si può dedurre dalla loro relativa protezione dall’alchilazione rispetto alle guanine nel DNA a singolo e doppio filamento.

Il protocollo di mappatura chimica è riportato qui utilizzando B-CeP 1 (Figura 2A) come sonda per la caratterizzazione dell’aptamero legante la trombina (TBA), un DNA a 15 meri in grado di assumere la disposizione G4 in presenza di cationi di potassio^11,12. La disposizione G4 di TBA (G4-TBA) è direttamente confrontata con due controlli, vale a dire TBA nella forma a singolo filamento (ssTBA) e TBA ricotto alla sua sequenza complementare per formare il costrutto a doppio filamento (dsTBA) (Tabella 1). I prodotti delle reazioni di sondaggio vengono risolti mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide (PAGE) ad alta risoluzione a livello di singolo nucleotide localizzando i singoli addotti di alchilazione e la scissione del filamento di DNA sulle guanine alchilate. La visualizzazione sul gel è resa possibile dalla coniugazione dell’oligonucleotide TBA con un fluoroforo alla sua estremità 3′ (Tabella 1). Questo protocollo mostra come ripiegare TBA nelle sue diverse conformazioni (G4 e controlli) e come eseguire reazioni di sondaggio con B-CeP seguite da PAGE.