Summary

In Vitro Химическое картирование структур ДНК G-квадруплекса бис-3-хлорпиперидинами

Published: May 12, 2023
doi:

Summary

Бис-3-хлорпиперидины (B-CeP) являются полезными химическими зондами для идентификации и характеристики структур G-квадруплекса в матрицах ДНК in vitro. В этом протоколе подробно описана процедура проведения зондирующих реакций с B-CeP и растворения продуктов реакции с помощью электрофореза в полиакриламидном геле высокого разрешения.

Abstract

G-квадруплексы (G4) — это биологически значимые, неканонические структуры ДНК, которые играют важную роль в экспрессии генов и заболеваниях, представляя собой важные терапевтические мишени. Для характеристики ДНК in vitro в потенциальных G-квадруплекс-образующих последовательностях (PQS) требуются доступные методы. B-CeP — это класс алкилирующих агентов, которые оказались полезными химическими зондами для исследования структуры нуклеиновых кислот высшего порядка. В данной работе описывается новый химический картирующий анализ, использующий специфическую реакционную способность B-CeP с N7 гуанинов с последующим прямым расщеплением цепей в алкилированных Gs.

А именно, чтобы отличить складки G4 от развернутых форм ДНК, мы используем B-CeP 1 для зондирования тромбин-связывающего аптамера (TBA), 15-мерной ДНК, способной принимать расположение G4. Реакция B-CeP-реагирующих гуанинов с B-CeP 1 дает продукты, которые могут быть разрешены с помощью электрофореза в полиакриламидном геле (PAGE) высокого разрешения на однонуклеотидном уровне путем локализации отдельных аддуктов алкилирования и расщепления цепей ДНК на алкилированных гуанинах. Картирование с использованием B-CePs является простым и мощным инструментом для характеристики in vitro последовательностей ДНК, образующих G-квадруплекс, что позволяет точно определить местоположение гуанинов, участвующих в образовании G-тетрад.

Introduction

В дополнение к типичной двойной спирали Уотсона-Крика, нуклеиновые кислоты могут принимать различные вторичные структуры, такие как альтернативная форма G-квадруплекса (G4), из-за их богатых гуанином последовательностей. Структура G4 основана на образовании плоских тетрамеров, называемых G-тетрадами, в которых четыре гуанина взаимодействуют через водородные связи Хугстина. G-тетрады укладываются друг на друга и дополнительно стабилизируются одновалентными катионами, которые координируются в центре гуанинового ядра (рис. 1)1.

Figure 1
Рисунок 1: Схематическое изображение G-квадруплексной структуры. (A) Схематическое изображение G-тетрады. Планарная решетка стабилизируется спариванием оснований по Хугстину и центральным катионом (M+). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Последовательности, содержащие четыре или более последовательных прогонов, по крайней мере, двух последовательных гуаниновых нуклеотидов, являются потенциальными G-квадруплекс-образующими последовательностями (PQS), которые могут сворачиваться в G-квадруплексные структуры. PQS расположены во многих различных клеточных контекстах, таких как теломеры, промоторы генов, рибосомная ДНК и рекомбинационные сайты, и участвуют в регуляции многих биологическихпроцессов. Таким образом, идентификация и экспериментальная проверка G4 в геноме человека, которая в настоящее время осуществляется в основном с помощью вычислительных инструментов, является биологически значимойпроблемой. Для поддержки вычислительных прогнозов или обнаружения непредсказанных структур G4 здесь показан доступный метод, основанный на химическом картировании, для идентификации образования G4 в матрице ДНК, позволяющий точно идентифицировать гуанины, образующие структуру G-тетрады.

В представленном химическом картированном анализе используется различная реакционная способность бис-3-хлорпиперидинов (B-CeP) с гуанинами после образования структур G4. Благодаря своей высокой реакционной способности с нуклеофилами 4,5,6,7,8,9, B-CeP являются алкилирующими агентами нуклеиновых кислот, обладающими способностью очень эффективно реагировать с положением N7гуаниновых нуклеотидов10. Алкилирование сопровождается депуринацией и расщеплением цепей в одноцепочечных и двухцепочечных конструкциях ДНК. Напротив, гуанины, участвующие в образовании G-тетрад в G4-расположениях, невосприимчивы к алкилированию B-CeP, так как положение N7 гуанинов вовлечено в водородные связи Хугстина. Эта специфическая реакционная способность B-CeP позволяет не только обнаруживать структуры G4, но и идентифицировать гуанины, образующие тетраду (тетрады), поскольку они могут быть выведены из их относительной защиты от алкилирования по сравнению с гуанинами в одноцепочечной и двухцепочечной ДНК.

Протокол химического картирования представлен здесь с использованием B-CeP 1 (рис. 2A) в качестве зонда для характеристики тромбин-связывающего аптамера (TBA), 15-мерной ДНК, способной принимать расположение G4 в присутствии катионов калия11,12. Расположение G4 TBA (G4-TBA) напрямую сравнивается с двумя контрольными группами, а именно TBA в одноцепочечной форме (ssTBA) и TBA, отожженной до ее комплементарной последовательности с образованием двухцепочечной конструкции (dsTBA) (табл. 1). Продукты зондирующих реакций растворяются с помощью электрофореза в полиакриламидном геле (PAGE) высокого разрешения на однонуклеотидном уровне путем локализации отдельных аддуктов алкилирования и расщепления цепей ДНК на алкилированных гуанинах. Визуализация на геле обеспечивается конъюгацией олигонуклеотида TBA с флуорофором на его 3′-конце (табл. 1). В этом протоколе показано, как сворачивать TBA в различных конформациях (G4 и контроль), а также как проводить зондирующие реакции с B-CeP с последующим PAGE.

Protocol

1. Подготовка нуклеиновых кислот и химических зондов Нуклеиновые кислотыПРИМЕЧАНИЕ: Олигонуклеотид под названием «TBA» представляет собой 15-мерную последовательность ДНК 5′-GGT-TGG-TGG-TGT-GGT-TGG-3′, помеченную на 3′-конце флуорофором 5-карбоксифлуоресцеином (FAM) для обеспечения ви?…

Representative Results

На рисунке 2 показан репрезентативный результат проведенного химического картирования, как описано в протоколе, с B-CeP 1 на олигонуклеотиде TBA, свернутом в три различные структуры. TG-квадруплексное расположение TBA (G4-TBA) было получено путем сворачивания олигонуклеотида в BP…

Discussion

G-квадруплексы представляют собой вторичные структуры нуклеиновых кислот, которые обычно сворачиваются в богатых гуанином последовательностях ДНК и являются важными объектами исследований из-за их связи с генетическим контролем и заболеваниями. Химическое картирование с помощью B-CeP…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана Департаментом фармацевтических и фармакологических наук Университета Падуи (PRIDJ-BIRD2019).

Materials

Acrylamide/bis-acrylamide solution 40% Applichem A3658 R45-46-20/21-25-36/38-43-48/23/
24/25-62
Ammonium per-sulfate (APS) Sigma Aldrich A7460
Analytical balance Mettler Toledo
Autoclave pbi international
Boric acid Sigma Aldrich B0252
Bromophenol blue Brilliant blue R Sigma Aldrich B0149
di-Sodium hydrogen phosphate dodecahydrate Fluka 71649
DMSO Sigma Aldrich 276855
DNA oligonucleotides Integrated DNA Technologies synthesis of custom sequences
EDTA disodium Sigma Aldrich E5134
Formamide Fluka 40248 H351-360D-373
Gel imager GE Healtcare STORM B40
Glycerol Sigma Aldrich G5516
Micro tubes 0.5 mL Sarstedt 72.704
Potassium Chloride Sigma Aldrich P9541
Sequencing apparatus Biometra Model S2
Silanization solution I Fluka 85126 H225, 314, 318, 336, 304, 400, 410
Sodium phosphate monobasic Carlo Erba 480086
Speedvac concentrator Thermo Scientific Savant DNA 120
TEMED Fluka 87689 R11-21/22-23-34
Tris-HCl MERCK 1.08387.2500
Urea Sigma Aldrich 51456
UV-Vis spectrophotometer Thermo Scientific Nanodrop 1000

References

  1. Davis, J. T. G-quartets 40 years later: from 5′-GMP to molecular biology and supramolecular chemistry. Angewandte Chemie. 43 (6), 668-698 (2004).
  2. Varshney, D., Spiegel, J., Zyner, K., Tannahill, D., Balasubramanian, S. The regulation and functions of DNA and RNA G-quadruplexes. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (8), 459-474 (2020).
  3. Chambers, V. S., et al. High-throughput sequencing of DNA G-quadruplex structures in the human genome. Nature Biotechnology. 33 (8), 877-881 (2015).
  4. Zuravka, I., Sosic, A., Gatto, B., Gottlich, R. Synthesis and evaluation of a bis-3-chloropiperidine derivative incorporating an anthraquinone pharmacophore. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 25 (20), 4606-4609 (2015).
  5. Zuravka, I., Roesmann, R., Sosic, A., Gottlich, R., Gatto, B. Bis-3-chloropiperidines containing bridging lysine linkers: Influence of side chain structure on DNA alkylating activity. Bioorganic & Medicinal Chemistry. 23 (6), 1241-1250 (2015).
  6. Zuravka, I., et al. Synthesis and DNA cleavage activity of bis-3-chloropiperidines as alkylating agents. ChemMedChem. 9 (9), 2178-2185 (2014).
  7. Sosic, A., Gottlich, R., Fabris, D., Gatto, B. B-CePs as cross-linking probes for the investigation of RNA higher-order structure. Nucleic Acids Research. 49 (12), 6660-6672 (2021).
  8. Sosic, A., et al. Bis-3-chloropiperidines targeting TAR RNA as a novel strategy to impair the HIV-1 nucleocapsid protein. Molecules. 26 (7), 1874 (2021).
  9. Sosic, A., et al. In vitro evaluation of bis-3-chloropiperidines as RNA modulators targeting TAR and TAR-protein interaction. International Journal of Molecular Sciences. 23 (2), 582 (2022).
  10. Sosic, A., et al. Direct and topoisomerase II mediated DNA damage by bis-3-chloropiperidines: The importance of being an earnest G. ChemMedChem. 12 (17), 1471-1479 (2017).
  11. Bock, L. C., Griffin, L. C., Latham, J. A., Vermaas, E. H., Toole, J. J. Selection of single-stranded DNA molecules that bind and inhibit human thrombin. Nature. 355 (6360), 564-566 (1992).
  12. Paborsky, L. R., McCurdy, S. N., Griffin, L. C., Toole, J. J., Leung, L. L. The single-stranded DNA aptamer-binding site of human thrombin. The Journal of Biological Chemistry. 268 (28), 20808-20811 (1993).
  13. Carraro, C., et al. Behind the mirror: chirality tunes the reactivity and cytotoxicity of chloropiperidines as potential anticancer agents. ACS Medicinal Chemistry Letters. 10 (4), 552-557 (2019).
  14. Carraro, C., et al. Appended aromatic moieties in flexible bis-3-chloropiperidines confer tropism against pancreatic cancer cells. ChemMedChem. 16 (5), 860-868 (2021).
  15. Kypr, J., Kejnovska, I., Renciuk, D., Vorlickova, M. Circular dichroism and conformational polymorphism of DNA. Nucleic Acids Research. 37 (6), 1713-1725 (2009).
  16. Onel, B., Wu, G., Sun, D., Lin, C., Yang, D. Electrophoretic mobility shift assay and dimethyl sulfate footprinting for characterization of G-quadruplexes and G-quadruplex-protein complexes. Methods in Molecular Biology. 2035, 201-222 (2019).

Play Video

Cite This Article
Sosic, A., Dal Lago, C., Göttlich, R., Gatto, B. In Vitro Chemical Mapping of G-Quadruplex DNA Structures by Bis-3-Chloropiperidines. J. Vis. Exp. (195), e65373, doi:10.3791/65373 (2023).

View Video