In vitro Mapeo químico de estructuras de ADN G-cuádruple por bis-3-cloropiperidinas
Summary
Las bis-3-cloroperiperidinas (B-CeP) son sondas químicas útiles para identificar y caracterizar estructuras G-cuádruples en plantillas de ADN in vitro. Este protocolo detalla el procedimiento para realizar reacciones de sondeo con B-CePs y para resolver los productos de reacción mediante electroforesis en gel de poliacrilamida de alta resolución.
Abstract
Los G-cuádruples (G4) son estructuras de ADN no canónicas biológicamente relevantes que desempeñan un papel importante en la expresión génica y las enfermedades, representando importantes dianas terapéuticas. Se requieren métodos accesibles para la caracterización in vitro del ADN dentro de posibles secuencias formadoras de G-cuádruples (PQS). Los B-CeP son una clase de agentes alquilantes que han demostrado ser sondas químicas útiles para la investigación de la estructura de orden superior de los ácidos nucleicos. En este trabajo se describe un nuevo ensayo de mapeo químico que explota la reactividad específica de los B-CeP con el N7 de las guaninas, seguido de la escisión directa de la hebra en los Gs alquilados.
Es decir, para distinguir los pliegues G4 de las formas de ADN desplegadas, utilizamos B-CeP 1 para sondear el aptámero de unión a trombina (TBA), un ADN de 15 meros capaz de asumir la disposición G4. La reacción de las guaninas que responden a B-CeP con B-CeP 1 produce productos que pueden resolverse mediante electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) de alta resolución a nivel de un solo nucleótido mediante la localización de aductos de alquilación individuales y la escisión de la cadena de ADN en las guaninas alquiladas. El mapeo mediante B-CePs es una herramienta sencilla y potente para la caracterización in vitro de secuencias de ADN formadoras de G-cuádruples, lo que permite la localización precisa de guaninas implicadas en la formación de G-tétradas.
Introduction
Además de la típica doble hélice de Watson-Crick, los ácidos nucleicos pueden adoptar varias estructuras secundarias, como la forma alternativa G-quadruplex (G4), debido a sus secuencias ricas en guanina. La estructura de G4 se basa en la formación de tetrámeros planos, llamados G-tétradas, en los que cuatro guaninas interactúan a través de enlaces de hidrógeno de Hoogsteen. Las tétradas G se apilan y se estabilizan aún más mediante cationes monovalentes que se coordinan en el centro del núcleo de guanina (Figura 1)1.
Figura 1: Representación esquemática de una estructura G-cuádruple. (A) Representación esquemática de una G-tétrada. La matriz plana se estabiliza mediante el apareamiento de bases de Hoogsteen y mediante un catión central (M+). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Las secuencias con cuatro o más corridas de al menos dos nucleótidos consecutivos de guanina son secuencias potenciales de formación de G-cuádruples (PQS) que pueden plegarse en estructuras G-cuádruples. Las PQS se localizan en muchos contextos celulares diferentes, como los telómeros, los promotores de genes, el ADN ribosómico y los sitios de recombinación, y están involucradas en la regulación de muchos procesos biológicos2. Por lo tanto, la identificación y validación experimental de G4s en el genoma humano, que actualmente se realiza principalmente a través de herramientas computacionales, es un tema biológicamente relevante3. Con el fin de apoyar las predicciones computacionales o detectar estructuras G4 no predichas, aquí se muestra un método accesible basado en el mapeo químico para identificar la formación de G4 en una plantilla de ADN, que permite la identificación precisa de las guaninas que forman la estructura de la tétrada G.
El ensayo de mapeo químico reportado explota la diferente reactividad de las bis-3-cloroperiperidinas (B-CePs) con guaninas después de la formación de estructuras G4. Debido a su alta reactividad con los nucleófilos 4,5,6,7,8,9, los B-CeP son agentes alquilantes de ácidos nucleicos con la capacidad de reaccionar de manera muy eficiente con la posición N7 de los nucleótidos de guanina10. La alquilación es seguida por la desurinación y la escisión de la hebra en las construcciones de ADN monocatenario y bicatenario. Por el contrario, las guaninas involucradas en la formación de las tétradas G en los arreglos G4 son impermeables a la alquilación B-CeP, ya que la posición N7 de las guaninas está implicada en los enlaces de hidrógeno de Hoogsteen. Esta reactividad específica de los B-CeP permite no solo la detección de estructuras G4, sino también la identificación de las guaninas que forman la(s) tétrada(s), ya que se pueden deducir de su relativa protección contra la alquilación en comparación con las guaninas en ADN monocatenario y bicatenario.
El protocolo de mapeo químico se presenta utilizando B-CeP 1 (Figura 2A) como sonda para la caracterización del aptámero de unión a trombina (TBA), un ADN de 15 meros capaz de asumir la disposición G4 en presencia de cationes de potasio11,12. La disposición G4 de TBA (G4-TBA) se compara directamente con dos controles, a saber, TBA en forma monocatenaria (ssTBA) y TBA recocido a su secuencia complementaria para formar la construcción bicatenaria (dsTBA) (Tabla 1). Los productos de las reacciones de sondeo se resuelven mediante electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) de alta resolución a nivel de un solo nucleótido mediante la localización de aductos de alquilación individuales y la escisión de la cadena de ADN en las guaninas alquiladas. La visualización en el gel es posible mediante la conjugación del oligonucleótido TBA con un fluoróforo en su extremo 3′ (Tabla 1). Este protocolo muestra cómo plegar TBA en sus diferentes conformaciones (G4 y controles), y cómo realizar reacciones de sondaje con B-CeP seguidas de PAGE.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los G-cuádruples son estructuras secundarias de ácidos nucleicos que normalmente se pliegan dentro de secuencias de ADN ricas en guanina, y son importantes objetivos de investigación debido a su asociación con el control genético y las enfermedades. El mapeo químico por B-CePs es un protocolo útil para la caracterización de los G4 de ADN, que se puede utilizar para identificar las bases de guanina involucradas en la formación de G-tétradas en condiciones fisiológicas de sal.
La sond…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo contó con el apoyo del Departamento de Ciencias Farmacéuticas y Farmacológicas de la Universidad de Padua (PRIDJ-BIRD2019).
Materials
| Acrylamide/bis-acrylamide solution 40% | Applichem | A3658 | R45-46-20/21-25-36/38-43-48/23/ 24/25-62 |
| Ammonium per-sulfate (APS) | Sigma Aldrich | A7460 | |
| Analytical balance | Mettler Toledo | ||
| Autoclave | pbi international | ||
| Boric acid | Sigma Aldrich | B0252 | |
| Bromophenol blue Brilliant blue R | Sigma Aldrich | B0149 | |
| di-Sodium hydrogen phosphate dodecahydrate | Fluka | 71649 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | 276855 | |
| DNA oligonucleotides | Integrated DNA Technologies | synthesis of custom sequences | |
| EDTA disodium | Sigma Aldrich | E5134 | |
| Formamide | Fluka | 40248 | H351-360D-373 |
| Gel imager | GE Healtcare | STORM B40 | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G5516 | |
| Micro tubes 0.5 mL | Sarstedt | 72.704 | |
| Potassium Chloride | Sigma Aldrich | P9541 | |
| Sequencing apparatus | Biometra | Model S2 | |
| Silanization solution I | Fluka | 85126 | H225, 314, 318, 336, 304, 400, 410 |
| Sodium phosphate monobasic | Carlo Erba | 480086 | |
| Speedvac concentrator | Thermo Scientific | Savant DNA 120 | |
| TEMED | Fluka | 87689 | R11-21/22-23-34 |
| Tris-HCl | MERCK | 1.08387.2500 | |
| Urea | Sigma Aldrich | 51456 | |
| UV-Vis spectrophotometer | Thermo Scientific | Nanodrop 1000 |
References
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