Un conjunto de técnicas de cribado para una visión general rápida de la función de los neutrófilos
Summary
Este protocolo presenta un conjunto de ensayos funcionales de neutrófilos que se utilizarán como método de cribado para cubrir las funciones de diferentes vías de señalización. El protocolo incluye una evaluación inicial y sencilla de la viabilidad celular, la pureza, la producción de especies reactivas de oxígeno, la migración en tiempo real, la fagocitosis y una sugerencia preliminar de trampas extracelulares de neutrófilos.
Abstract
Los neutrófilos son conocidos como una de las primeras líneas de defensa en la respuesta inmune innata y pueden realizar muchas funciones celulares particulares, como la quimiotaxis, la migración inversa, la fagocitosis, la degranulación de enzimas y metabolitos citotóxicos y la liberación de ADN como trampas extracelulares de neutrófilos (NET). Los neutrófilos no solo tienen una señalización estrechamente regulada, sino que también participan en la regulación de otros componentes del sistema inmunológico. Dado que los neutrófilos frescos están diferenciados terminalmente, son de corta duración y muy variables entre los individuos, es importante aprovechar al máximo las muestras recogidas. A menudo, los investigadores necesitan realizar ensayos de detección para evaluar una visión general de las muchas funciones de los neutrófilos que pueden verse afectadas por afecciones específicas que se están evaluando. Para abordar esta necesidad se desarrolló un conjunto de pruebas que seguían un único proceso de aislamiento de neutrófilos de densidad normal, buscando un equilibrio entre velocidad, exhaustividad, coste y precisión. Los resultados se pueden utilizar para razonar y guiar estudios de seguimiento en profundidad. Este procedimiento se puede llevar a cabo en un tiempo promedio de 4 h e incluye la evaluación de la viabilidad celular, la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS), la migración en tiempo real y la fagocitosis de levaduras en portaobjetos de vidrio, dejando suficientes células para enfoques más detallados como estudios ómicos. Además, el procedimiento incluye una forma de observar fácilmente una sugerencia preliminar de NETs después de una tinción panóptica rápida observada por microscopía óptica, con una falta de marcadores específicos, aunque lo suficiente como para indicar si valdría la pena realizar más esfuerzos en ese sentido. La diversidad de funciones probadas combina puntos comunes entre las pruebas, reduciendo el tiempo y los gastos de análisis. El procedimiento se denominó NeutroFun Screen, y aunque tiene limitaciones, equilibra los factores antes mencionados. Además, el objetivo de este trabajo no es un conjunto de pruebas definido, sino más bien una guía que se pueda ajustar fácilmente a los recursos y demandas de cada laboratorio.
Introduction
Los neutrófilos son las células inmunitarias innatas más abundantes en la sangre humana y se sabe que desempeñan un papel importante en la infección y la inflamación, siendo los primeros en responder al sitio del daño tisular. En los últimos años, ha habido un creciente reconocimiento del papel crucial que desempeñan los neutrófilos en una variedad de enfermedades y en el apoyo a la homeostasis2. Los neutrófilos no solo tienen una señalización estrechamente regulada, sino que también participan en la regulación de otros componentes del sistema inmune 3,4,5. Por lo tanto, la investigación de los neutrófilos y sus muchas funciones celulares inusuales, como la quimiotaxis, la migración inversa6, la fagocitosis7, el estallido respiratorio8 y la liberación de trampas extracelulares de neutrófilos (NET)7, es imperativo en numerosos contextos de investigación donde es necesario evaluar los posibles cambios funcionales, morfológicos o moleculares de los neutrófilos desencadenados por condiciones específicas bajo análisis.
Los neutrófilos recién aislados son terminalmente diferenciados, de vida corta, altamente dinámicos y fácilmente activados9. Sin embargo, aún no se ha logrado un método de almacenamiento eficiente que no afecte las respuestas de los neutrófilos, lo que dificulta la realización de múltiples ensayos que deben ser ininterrumpidos. Además, los análisis funcionales descritos anteriormente10,11, basados en ensayos que requieren citometría y/o tinción fluorescente, pueden no ser una opción viable cuando se necesita una evaluación amplia e inicial del neutrófilo.
Para abordar estos problemas, este protocolo describe un conjunto de pruebas que se pueden llevar a cabo siguiendo un único proceso de aislamiento, incluida la evaluación de la viabilidad celular, la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS), la migración en tiempo real y la fagocitosis de Saccharomyces cerevisiae, cuyos resultados pueden utilizarse para razonar estudios de seguimiento en profundidad. Este procedimiento, denominado NeutroFun Screen, fue diseñado para abarcar las principales actividades efectoras, excepto la degranulación, y puede completarse en un tiempo promedio de 4 h, incluyendo 1 h de activación. Además, las celdas restantes se pueden utilizar para enfoques más detallados, como estudios ómicos. La ventaja de este método radica en su equilibrio entre velocidad, exhaustividad, costo y precisión.
Además, hay una manera de observar fácilmente una sugerencia preliminar de NET, sin marcadores específicos, pero suficiente para indicar si valdría la pena realizar más esfuerzos en esa dirección. La diversidad de funciones probadas tiene como objetivo combinar puntos comunes entre las pruebas, reduciendo el tiempo y los gastos de análisis. El objetivo principal de este método es proporcionar un análisis funcional equilibrado con respecto a la velocidad, la exhaustividad, el costo y la precisión que permita una visión general de la respuesta de los neutrófilos, lo que lo convierte en un paso inicial útil en la investigación de los efectos de nuevos estímulos en los neutrófilos de densidad normal.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los neutrófilos son células altamente dinámicas y receptivas que tienen una vida corta y aún no pueden ser criopreservadas19, lo que dificulta las investigaciones sobre su biología. Por lo tanto, es esencial seguir pasos cuidadosos para obtener neutrófilos viables, enriquecidos y en reposo11,20. En este estudio se empleó una técnica de aislamiento basada en la densidad que enfatiza la manipulación suave y mínima, así como el uso…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores reconocen a las siguientes agencias de financiamiento: FAPDF, CNPq, CAPES, UnB, FINEP y FINATEC.
Materials
| CIM-Plate 16 | Agilent | 5665825001 | |
| CLARIOstar Plate Reader | BMG LABTECH | US Patent Number 9,733,124 Product details: MARS Data Analysis Software |
|
| Dimethyl sulfoxide | Dinâmica | 1582 | |
| DNAse I | Sigma – Aldrich | DN 25 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Sigma – Aldrich | E5134 | |
| Fast panoptic stain | Laborclin | 620529 | |
| Glass slide | Exacta | 7102 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution with calcium, with magnesium, without phenol red. | Sigma – Aldrich | 55037C | |
| Hank’s Balanced Salt Solution without calcium chloride, magnesium sulfate and sodium bicarbonate. | Sigma – Aldrich | H4641 | |
| Heparin | Blau | 7896014655229 | |
| Laminar flow cabinet | Veco | VLFS-12 | |
| Microscope | Zeiss | 415501-0101-002 | Product details: Primostar 1 |
| Mixing Block | BIOER | MB-102 | |
| Neubauer improved bright-lined | New Optik | 1110000 | |
| N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine | Sigma – Aldrich | F3506 | |
| Nitroblue tetrazolium | Neon | CAS 298-83-9 | |
| Percoll | Cytiva | 17089101 | separation media |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma – Aldrich | P8139 | |
| Phosphate buffered saline tablet | Sigma – Aldrich | P4417 | |
| ROTOFIX 32 A | Hettich | 1206 | |
| Saccharomyces cerevisiae | Fleischmann | ||
| Safranin | Sigma – Aldrich | 50240 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Cytiva | 17-1313-01 | |
| Sonicator | Qsonica | Q125 | |
| Trypan blue solution | Vetec | C.I. 23850 | |
| Vortex Genie 2 | Scientific Industries, Inc. | 0K-0500-902 | |
| xCELLigence Real-Time Cell Analysis (RTCA) DP (dual purpose) | Agilent | 380601050 | Product details: RTCA system composed of detection hardware, cell plates and software |
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