Summary

Un conjunto de técnicas de cribado para una visión general rápida de la función de los neutrófilos

Published: February 09, 2024
doi:

Summary

Este protocolo presenta un conjunto de ensayos funcionales de neutrófilos que se utilizarán como método de cribado para cubrir las funciones de diferentes vías de señalización. El protocolo incluye una evaluación inicial y sencilla de la viabilidad celular, la pureza, la producción de especies reactivas de oxígeno, la migración en tiempo real, la fagocitosis y una sugerencia preliminar de trampas extracelulares de neutrófilos.

Abstract

Los neutrófilos son conocidos como una de las primeras líneas de defensa en la respuesta inmune innata y pueden realizar muchas funciones celulares particulares, como la quimiotaxis, la migración inversa, la fagocitosis, la degranulación de enzimas y metabolitos citotóxicos y la liberación de ADN como trampas extracelulares de neutrófilos (NET). Los neutrófilos no solo tienen una señalización estrechamente regulada, sino que también participan en la regulación de otros componentes del sistema inmunológico. Dado que los neutrófilos frescos están diferenciados terminalmente, son de corta duración y muy variables entre los individuos, es importante aprovechar al máximo las muestras recogidas. A menudo, los investigadores necesitan realizar ensayos de detección para evaluar una visión general de las muchas funciones de los neutrófilos que pueden verse afectadas por afecciones específicas que se están evaluando. Para abordar esta necesidad se desarrolló un conjunto de pruebas que seguían un único proceso de aislamiento de neutrófilos de densidad normal, buscando un equilibrio entre velocidad, exhaustividad, coste y precisión. Los resultados se pueden utilizar para razonar y guiar estudios de seguimiento en profundidad. Este procedimiento se puede llevar a cabo en un tiempo promedio de 4 h e incluye la evaluación de la viabilidad celular, la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS), la migración en tiempo real y la fagocitosis de levaduras en portaobjetos de vidrio, dejando suficientes células para enfoques más detallados como estudios ómicos. Además, el procedimiento incluye una forma de observar fácilmente una sugerencia preliminar de NETs después de una tinción panóptica rápida observada por microscopía óptica, con una falta de marcadores específicos, aunque lo suficiente como para indicar si valdría la pena realizar más esfuerzos en ese sentido. La diversidad de funciones probadas combina puntos comunes entre las pruebas, reduciendo el tiempo y los gastos de análisis. El procedimiento se denominó NeutroFun Screen, y aunque tiene limitaciones, equilibra los factores antes mencionados. Además, el objetivo de este trabajo no es un conjunto de pruebas definido, sino más bien una guía que se pueda ajustar fácilmente a los recursos y demandas de cada laboratorio.

Introduction

Los neutrófilos son las células inmunitarias innatas más abundantes en la sangre humana y se sabe que desempeñan un papel importante en la infección y la inflamación, siendo los primeros en responder al sitio del daño tisular. En los últimos años, ha habido un creciente reconocimiento del papel crucial que desempeñan los neutrófilos en una variedad de enfermedades y en el apoyo a la homeostasis2. Los neutrófilos no solo tienen una señalización estrechamente regulada, sino que también participan en la regulación de otros componentes del sistema inmune 3,4,5. Por lo tanto, la investigación de los neutrófilos y sus muchas funciones celulares inusuales, como la quimiotaxis, la migración inversa6, la fagocitosis7, el estallido respiratorio8 y la liberación de trampas extracelulares de neutrófilos (NET)7, es imperativo en numerosos contextos de investigación donde es necesario evaluar los posibles cambios funcionales, morfológicos o moleculares de los neutrófilos desencadenados por condiciones específicas bajo análisis.

Los neutrófilos recién aislados son terminalmente diferenciados, de vida corta, altamente dinámicos y fácilmente activados9. Sin embargo, aún no se ha logrado un método de almacenamiento eficiente que no afecte las respuestas de los neutrófilos, lo que dificulta la realización de múltiples ensayos que deben ser ininterrumpidos. Además, los análisis funcionales descritos anteriormente10,11, basados en ensayos que requieren citometría y/o tinción fluorescente, pueden no ser una opción viable cuando se necesita una evaluación amplia e inicial del neutrófilo.

Para abordar estos problemas, este protocolo describe un conjunto de pruebas que se pueden llevar a cabo siguiendo un único proceso de aislamiento, incluida la evaluación de la viabilidad celular, la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS), la migración en tiempo real y la fagocitosis de Saccharomyces cerevisiae, cuyos resultados pueden utilizarse para razonar estudios de seguimiento en profundidad. Este procedimiento, denominado NeutroFun Screen, fue diseñado para abarcar las principales actividades efectoras, excepto la degranulación, y puede completarse en un tiempo promedio de 4 h, incluyendo 1 h de activación. Además, las celdas restantes se pueden utilizar para enfoques más detallados, como estudios ómicos. La ventaja de este método radica en su equilibrio entre velocidad, exhaustividad, costo y precisión.

Además, hay una manera de observar fácilmente una sugerencia preliminar de NET, sin marcadores específicos, pero suficiente para indicar si valdría la pena realizar más esfuerzos en esa dirección. La diversidad de funciones probadas tiene como objetivo combinar puntos comunes entre las pruebas, reduciendo el tiempo y los gastos de análisis. El objetivo principal de este método es proporcionar un análisis funcional equilibrado con respecto a la velocidad, la exhaustividad, el costo y la precisión que permita una visión general de la respuesta de los neutrófilos, lo que lo convierte en un paso inicial útil en la investigación de los efectos de nuevos estímulos en los neutrófilos de densidad normal.

Protocol

Todos los experimentos siguieron estrictamente las directrices éticas establecidas por el comité de revisión institucional de la Universidad de Brasilia (proceso 13364819.0.0000.5558), y las muestras fueron identificadas por códigos para garantizar el anonimato de los donantes. Las células se obtuvieron de donantes masculinos sanos normales de entre 18 y 35 años, que firmaron el consentimiento informado y cumplieron con los siguientes criterios de elegibilidad: no fumadores/vapeadores, sin condiciones de salud cró…

Representative Results

El método de aislamiento basado en la densidad utilizado en este estudio (Figura 1) cumplió con los criterios de los experimentos propuestos. Los parámetros de neutrófilos obtenidos con este método incluyeron viabilidad ≥98%, pureza ≥94% y rendimiento celular ≥1,5 x 107, sin activación detectable por las pruebas de cribado. Dos pasos relevantes en el aislamiento de PMN son la anticoagulación y la eliminación de los glóbulos rojos. Mantener el tubo sanguíneo anticoa…

Discussion

Los neutrófilos son células altamente dinámicas y receptivas que tienen una vida corta y aún no pueden ser criopreservadas19, lo que dificulta las investigaciones sobre su biología. Por lo tanto, es esencial seguir pasos cuidadosos para obtener neutrófilos viables, enriquecidos y en reposo11,20. En este estudio se empleó una técnica de aislamiento basada en la densidad que enfatiza la manipulación suave y mínima, así como el uso…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores reconocen a las siguientes agencias de financiamiento: FAPDF, CNPq, CAPES, UnB, FINEP y FINATEC.

Materials

CIM-Plate 16 Agilent  5665825001
CLARIOstar Plate Reader  BMG LABTECH US Patent Number 9,733,124
Product details: MARS Data Analysis Software
Dimethyl sulfoxide Dinâmica 1582
DNAse I Sigma – Aldrich DN 25
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate Sigma – Aldrich E5134
Fast panoptic stain Laborclin 620529
Glass slide Exacta 7102
Hank’s Balanced Salt Solution with calcium, with magnesium, without phenol red. Sigma – Aldrich 55037C
Hank’s Balanced Salt Solution without calcium chloride, magnesium sulfate and sodium bicarbonate. Sigma – Aldrich H4641
Heparin Blau  7896014655229
Laminar flow cabinet Veco VLFS-12
Microscope Zeiss 415501-0101-002 Product details: Primostar 1
Mixing Block BIOER MB-102
Neubauer improved bright-lined New Optik 1110000
N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine Sigma – Aldrich F3506
Nitroblue tetrazolium Neon CAS 298-83-9
Percoll Cytiva 17089101 separation media
Phorbol 12-myristate 13-acetate Sigma – Aldrich P8139
Phosphate buffered saline tablet Sigma – Aldrich P4417
ROTOFIX 32 A Hettich 1206
Saccharomyces cerevisiae Fleischmann
Safranin Sigma – Aldrich 50240
Sodium dodecyl sulfate Cytiva 17-1313-01
Sonicator Qsonica Q125
Trypan blue solution Vetec C.I. 23850
Vortex Genie 2 Scientific Industries, Inc. 0K-0500-902
xCELLigence Real-Time Cell Analysis (RTCA) DP (dual purpose) Agilent  380601050 Product details: RTCA system composed of detection hardware, cell plates and software

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Souza Luz, I., Takaya, R., Gonzaga Ribeiro, D., Sales Silva, N., Fontes, L., Castro, M. S., Fontes, W. A Set of Screening Techniques for a Quick Overview of the Neutrophil Function. J. Vis. Exp. (204), e65329, doi:10.3791/65329 (2024).

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