Summary

Una serie di tecniche di screening per una rapida panoramica della funzione dei neutrofili

Published: February 09, 2024
doi:

Summary

Questo protocollo presenta una serie di saggi funzionali dei neutrofili da utilizzare come metodo di screening per coprire le funzioni di diverse vie di segnalazione. Il protocollo include una valutazione iniziale e semplice della vitalità cellulare, della purezza, della produzione di specie reattive dell’ossigeno, della migrazione in tempo reale, della fagocitosi e di un suggerimento preliminare di trappole extracellulari per neutrofili.

Abstract

I neutrofili sono noti come una delle prime linee di difesa nella risposta immunitaria innata e possono svolgere molte funzioni cellulari particolari, come la chemiotassi, la migrazione inversa, la fagocitosi, la degranulazione di enzimi e metaboliti citotossici e il rilascio di DNA come trappole extracellulari per neutrofili (NET). I neutrofili non solo hanno una segnalazione strettamente regolata, ma partecipano anche alla regolazione di altri componenti del sistema immunitario. Poiché i neutrofili freschi sono terminalmente differenziati, di breve durata e altamente variabili tra gli individui, è importante sfruttare al meglio i campioni raccolti. I ricercatori hanno spesso bisogno di eseguire saggi di screening per valutare una panoramica delle numerose funzioni dei neutrofili che possono essere influenzate da condizioni specifiche in fase di valutazione. Per rispondere a questa esigenza è stata sviluppata una serie di test che seguono un singolo processo di isolamento di neutrofili a densità normale, cercando un equilibrio tra velocità, completezza, costi e precisione. I risultati possono essere utilizzati per ragionare e guidare studi di follow-up approfonditi. Questa procedura può essere eseguita in un tempo medio di 4 ore e include la valutazione della vitalità cellulare, la produzione di specie reattive dell’ossigeno (ROS), la migrazione in tempo reale e la fagocitosi del lievito su vetrini, lasciando un numero sufficiente di cellule per approcci più dettagliati come gli studi omici. Inoltre, la procedura include un modo per osservare facilmente un suggerimento preliminare di NET dopo una rapida colorazione panottica osservata dalla microscopia ottica, con una mancanza di marcatori specifici, anche se sufficienti per indicare se ulteriori sforzi in questo modo varrebbero la pena. La diversità delle funzioni testate combina punti comuni tra i test, riducendo i tempi e i costi di analisi. La procedura è stata chiamata NeutroFun Screen e, pur avendo delle limitazioni, bilancia i fattori sopra citati. Inoltre, lo scopo di questo lavoro non è un set di test definito, ma piuttosto una linea guida che può essere facilmente adattata alle risorse e alle esigenze di ciascun laboratorio.

Introduction

I neutrofili sono le cellule immunitarie innate più abbondanti nel sangue umano e sono noti per svolgere un ruolo importante nelle infezioni e nell’infiammazione, essendo i primi soccorritori ad arrivare al sitodel danno tissutale. Negli ultimi anni, c’è stato un crescente riconoscimento del ruolo cruciale che i neutrofili svolgono in una varietà di malattie e nel sostenere l’omeostasi2. I neutrofili non solo hanno una segnalazione strettamente regolata, ma partecipano anche alla regolazione di altri componenti del sistema immunitario 3,4,5. Pertanto, lo studio dei neutrofili e delle loro numerose funzioni cellulari insolite, come la chemiotassi, la migrazione inversa6, la fagocitosi7, il burst respiratorio8 e il rilascio di trappole extracellulari per neutrofili (NET)7, è fondamentale in numerosi contesti di ricerca in cui è necessario valutare i potenziali cambiamenti funzionali, morfologici o molecolari dei neutrofili innescati da specifiche condizioni in analisi.

I neutrofili appena isolati sono terminalmente differenziati, di breve durata, altamente dinamici e facilmente attivabili9. Tuttavia, non è stato ancora raggiunto un metodo di conservazione efficiente che non influisca sulle risposte dei neutrofili, rendendo difficile l’esecuzione di più saggi che devono essere ininterrotti. Inoltre, le analisi funzionali10,11 precedentemente descritte, basate su saggi che richiedono citometria e/o colorazione fluorescente, potrebbero non essere una scelta praticabile quando è necessaria un’ampia e iniziale valutazione del neutrofilo.

Per affrontare questi problemi, questo protocollo descrive una serie di test che possono essere eseguiti a seguito di un singolo processo di isolamento, tra cui la valutazione della vitalità cellulare, la produzione di specie reattive dell’ossigeno (ROS), la migrazione in tempo reale e la fagocitosi di Saccharomyces cerevisiae, i cui risultati possono essere utilizzati per ragionare studi di follow-up approfonditi. Questa procedura, denominata NeutroFun Screen, è stata progettata per comprendere le principali attività effettrici, ad eccezione della degranulazione, e può essere completata in un tempo medio di 4 ore, inclusa 1 ora di attivazione. Inoltre, le cellule rimanenti possono essere utilizzate per approcci più dettagliati come gli studi omici. Il vantaggio di questo metodo risiede nel suo equilibrio tra velocità, completezza, costo e precisione.

Inoltre, c’è un modo per osservare facilmente un suggerimento preliminare di NET, senza marcatori specifici, ma sufficiente per indicare se ulteriori sforzi in quella direzione varrebbero la pena. La diversità delle funzioni testate ha lo scopo di combinare punti comuni tra i test, riducendo i tempi e i costi di analisi. L’obiettivo principale di questo metodo è quello di fornire un’analisi funzionale bilanciata per quanto riguarda la velocità, la completezza, il costo e l’accuratezza che consenta una panoramica della risposta del neutrofilo, rendendolo un utile passo iniziale nello studio degli effetti di nuovi stimoli sui neutrofili a densità normale.

Protocol

Tutti gli esperimenti hanno seguito rigorosamente le linee guida etiche stabilite dal comitato di revisione istituzionale dell’Università di Brasilia (processo 13364819.0.0000.5558) e i campioni sono stati identificati da codici per garantire l’anonimato del donatore. Le cellule sono state ottenute da donatori maschi sani normali di età compresa tra 18 e 35 anni, che hanno firmato il consenso informato e hanno soddisfatto i seguenti criteri di idoneità: non fumatori/vapers, nessuna condizione di salute cronica e nessu…

Representative Results

Il metodo di isolamento basato sulla densità utilizzato in questo studio (Figura 1) ha soddisfatto i criteri per gli esperimenti proposti. I parametri dei neutrofili ottenuti con questo metodo includevano vitalità ≥98%, purezza ≥94% e resa cellulare ≥1,5 x 107, senza alcuna attivazione rilevabile dai test di screening. Due fasi rilevanti nell’isolamento dei PMN sono l’anticoagulazione e la rimozione dei globuli rossi. Mantenere la provetta o la siringa anticoagulata a una …

Discussion

I neutrofili sono cellule altamente dinamiche e reattive che hanno vita breve e non possono ancora essere crioconservate19, rendendo difficili le indagini sulla loro biologia. Pertanto, è essenziale seguire attente misure per ottenere neutrofili vitali, arricchiti e a riposo11,20. Questo studio ha impiegato una tecnica di isolamento basata sulla densità che enfatizza la manipolazione delicata e minima, nonché l’uso di basse temperature …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori ringraziano le seguenti agenzie di finanziamento: FAPDF, CNPq, CAPES, UnB, FINEP e FINATEC.

Materials

CIM-Plate 16 Agilent  5665825001
CLARIOstar Plate Reader  BMG LABTECH US Patent Number 9,733,124
Product details: MARS Data Analysis Software
Dimethyl sulfoxide Dinâmica 1582
DNAse I Sigma – Aldrich DN 25
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate Sigma – Aldrich E5134
Fast panoptic stain Laborclin 620529
Glass slide Exacta 7102
Hank’s Balanced Salt Solution with calcium, with magnesium, without phenol red. Sigma – Aldrich 55037C
Hank’s Balanced Salt Solution without calcium chloride, magnesium sulfate and sodium bicarbonate. Sigma – Aldrich H4641
Heparin Blau  7896014655229
Laminar flow cabinet Veco VLFS-12
Microscope Zeiss 415501-0101-002 Product details: Primostar 1
Mixing Block BIOER MB-102
Neubauer improved bright-lined New Optik 1110000
N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine Sigma – Aldrich F3506
Nitroblue tetrazolium Neon CAS 298-83-9
Percoll Cytiva 17089101 separation media
Phorbol 12-myristate 13-acetate Sigma – Aldrich P8139
Phosphate buffered saline tablet Sigma – Aldrich P4417
ROTOFIX 32 A Hettich 1206
Saccharomyces cerevisiae Fleischmann
Safranin Sigma – Aldrich 50240
Sodium dodecyl sulfate Cytiva 17-1313-01
Sonicator Qsonica Q125
Trypan blue solution Vetec C.I. 23850
Vortex Genie 2 Scientific Industries, Inc. 0K-0500-902
xCELLigence Real-Time Cell Analysis (RTCA) DP (dual purpose) Agilent  380601050 Product details: RTCA system composed of detection hardware, cell plates and software

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Cite This Article
Souza Luz, I., Takaya, R., Gonzaga Ribeiro, D., Sales Silva, N., Fontes, L., Castro, M. S., Fontes, W. A Set of Screening Techniques for a Quick Overview of the Neutrophil Function. J. Vis. Exp. (204), e65329, doi:10.3791/65329 (2024).

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