مجموعة من تقنيات الفحص للحصول على نظرة عامة سريعة على وظيفة العدلات
Summary
يتميز هذا البروتوكول بمجموعة من المقايسات الوظيفية للعدلات لاستخدامها كطريقة فحص لتغطية الوظائف من مسارات الإشارات المختلفة. يتضمن البروتوكول تقييما أوليا وبسيطا لصلاحية الخلية ، والنقاء ، وإنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية ، والهجرة في الوقت الفعلي ، والبلعمة ، واقتراح أولي لمصائد العدلات خارج الخلية.
Abstract
تعرف العدلات بأنها واحدة من خطوط الدفاع الأولى في الاستجابة المناعية الفطرية ويمكن أن تؤدي العديد من الوظائف الخلوية الخاصة ، مثل الانجذاب الكيميائي ، والهجرة العكسية ، والبلعمة ، وتحلل الإنزيمات السامة للخلايا والمستقلبات ، وإطلاق الحمض النووي كمصائد خارج الخلية للعدلات (NETs). لا تقوم العدلات بتنظيم الإشارات بإحكام فحسب ، بل تشارك أيضا في تنظيم المكونات الأخرى للجهاز المناعي. نظرا لأن العدلات الطازجة متباينة بشكل نهائي وقصيرة العمر ومتغيرة للغاية بين الأفراد ، فمن المهم تحقيق أقصى استفادة من العينات التي تم جمعها. غالبا ما يحتاج الباحثون إلى إجراء فحوصات الفحص لتقييم نظرة عامة على العديد من وظائف العدلات التي قد تتأثر بظروف معينة قيد التقييم. تم تطوير مجموعة من الاختبارات بعد عملية عزل واحدة للعدلات ذات الكثافة الطبيعية لتلبية هذه الحاجة ، سعيا لتحقيق التوازن بين السرعة والشمولية والتكلفة والدقة. يمكن استخدام النتائج لتبرير وتوجيه دراسات المتابعة المتعمقة. يمكن تنفيذ هذا الإجراء في متوسط وقت 4 ساعات ويتضمن تقييم صلاحية الخلية ، وإنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) ، والهجرة في الوقت الفعلي ، والبلعمة من الخميرة على الشرائح الزجاجية ، وترك خلايا كافية لنهج أكثر تفصيلا مثل دراسات omics. علاوة على ذلك ، يتضمن الإجراء طريقة لمراقبة اقتراح أولي للشبكات بسهولة بعد تلطيخ بانوبتيكي سريع لوحظ بواسطة المجهر الضوئي ، مع عدم وجود علامات محددة ، وإن كانت كافية للإشارة إلى ما إذا كان من المفيد بذل المزيد من الجهود بهذه الطريقة. يجمع تنوع الوظائف التي تم اختبارها بين النقاط المشتركة بين الاختبارات ، مما يقلل من وقت التحليل والنفقات. تم تسمية الإجراء باسم NeutroFun Screen ، وعلى الرغم من وجود قيود ، إلا أنه يوازن بين العوامل المذكورة أعلاه. علاوة على ذلك ، فإن الهدف من هذا العمل ليس مجموعة اختبار محددة ، بل هو مبدأ توجيهي يمكن تعديله بسهولة وفقا لموارد ومتطلبات كل مختبر.
Introduction
العدلات هي الخلايا المناعية الفطرية الأكثر وفرة في دم الإنسان ومن المعروف أنها تلعب دورا رئيسيا في العدوى والالتهابات ، كونها أول المستجيبين الذين يصلون إلى موقع تلف الأنسجة1. في السنوات الأخيرة ، كان هناك اعتراف متزايد بالدور الحاسم الذي تلعبه العدلات في مجموعة متنوعة من الأمراض وفي دعم التوازن2. لا تقوم العدلات بتنظيم الإشارات بإحكام فحسب ، بل تشارك أيضا في تنظيم المكونات الأخرى للجهاز المناعي3،4،5. لذلك ، فإن التحقيق في العدلات والعديد من وظائفها الخلوية غير العادية ، مثل الانجذاب الكيميائي ، والهجرة العكسية6 ، والبلعمة7 ، والانفجار التنفسي8 ، وإطلاق مصائد العدلات خارج الخلية (NETs) 7 ، أمر حتمي في العديد من سياقات البحث حيث يكون من الضروري تقييم التغيرات الوظيفية أو المورفولوجية أو الجزيئية المحتملة التي تسببها ظروف محددة قيد التحليل.
العدلات المعزولة حديثا متباينة بشكل نهائي ، وقصيرة العمر ، وديناميكية للغاية ، ويمكن تنشيطهابسهولة 9. ومع ذلك ، لم يتم بعد تحقيق طريقة تخزين فعالة لا تؤثر على استجابات العدلات ، مما يجعل من الصعب إجراء فحوصات متعددة يجب أن تكون دون انقطاع. علاوة على ذلك ، قد لا تكون التحليلات الوظيفية الموصوفةسابقا 10،11 ، بناء على المقايسات التي تتطلب قياس الخلايا و / أو تلطيخ الفلورسنت ، خيارا قابلا للتطبيق عند الحاجة إلى تقييم واسع وأولي للعدلات.
لمعالجة هذه المشكلات ، يصف هذا البروتوكول مجموعة من الاختبارات التي يمكن إجراؤها بعد عملية عزل واحدة ، بما في ذلك تقييم صلاحية الخلية ، وإنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) ، والهجرة في الوقت الفعلي ، والبلعمة في Saccharomyces cerevisiae ، والتي يمكن استخدام نتائجها لتبرير دراسات المتابعة المتعمقة. تم تصميم هذا الإجراء ، المسمى NeutroFun Screen ، ليشمل أنشطة المستجيب الرئيسية ، باستثناء التحبب ، ويمكن إكماله في متوسط وقت قدره 4 ساعات ، بما في ذلك 1 ساعة من التنشيط. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام الخلايا المتبقية لنهج أكثر تفصيلا مثل دراسات omics. تكمن ميزة هذه الطريقة في توازنها بين السرعة والشمولية والتكلفة والدقة.
وعلاوة على ذلك، هناك طريقة للمراقبة بسهولة لاقتراح أولي بشأن شبكات شبكية، دون علامات محددة، ولكنها تكفي لبيان ما إذا كان من المفيد بذل مزيد من الجهود في هذا الاتجاه. يهدف تنوع الوظائف التي تم اختبارها إلى الجمع بين النقاط المشتركة بين الاختبارات ، مما يقلل من وقت التحليل والنفقات. الهدف الرئيسي من هذه الطريقة هو توفير تحليل وظيفي متوازن فيما يتعلق بالسرعة والشمولية والتكلفة والدقة التي تسمح بإلقاء نظرة عامة على استجابة العدلات ، مما يجعلها خطوة أولية مفيدة في التحقيق في آثار المحفزات الجديدة على العدلات ذات الكثافة الطبيعية.
Protocol
Representative Results
Discussion
العدلات هي خلايا ديناميكية للغاية وسريعة الاستجابة وقصيرة العمر ولا يمكن حفظها بالتبريدحتى الآن 19 ، مما يجعل التحقيقات في بيولوجيتها صعبة. لذلك ، من الضروري اتباع خطوات دقيقة للحصول على العدلات القابلة للحياة والمخصبة والراحة11,20. استخدمت هذه …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يعترف المؤلفون بوكالات التمويل التالية: FAPDF و CNPq و CAPES و UnB و FINEP و FINATEC.
Materials
| CIM-Plate 16 | Agilent | 5665825001 | |
| CLARIOstar Plate Reader | BMG LABTECH | US Patent Number 9,733,124 Product details: MARS Data Analysis Software |
|
| Dimethyl sulfoxide | Dinâmica | 1582 | |
| DNAse I | Sigma – Aldrich | DN 25 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Sigma – Aldrich | E5134 | |
| Fast panoptic stain | Laborclin | 620529 | |
| Glass slide | Exacta | 7102 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution with calcium, with magnesium, without phenol red. | Sigma – Aldrich | 55037C | |
| Hank’s Balanced Salt Solution without calcium chloride, magnesium sulfate and sodium bicarbonate. | Sigma – Aldrich | H4641 | |
| Heparin | Blau | 7896014655229 | |
| Laminar flow cabinet | Veco | VLFS-12 | |
| Microscope | Zeiss | 415501-0101-002 | Product details: Primostar 1 |
| Mixing Block | BIOER | MB-102 | |
| Neubauer improved bright-lined | New Optik | 1110000 | |
| N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine | Sigma – Aldrich | F3506 | |
| Nitroblue tetrazolium | Neon | CAS 298-83-9 | |
| Percoll | Cytiva | 17089101 | separation media |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma – Aldrich | P8139 | |
| Phosphate buffered saline tablet | Sigma – Aldrich | P4417 | |
| ROTOFIX 32 A | Hettich | 1206 | |
| Saccharomyces cerevisiae | Fleischmann | ||
| Safranin | Sigma – Aldrich | 50240 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Cytiva | 17-1313-01 | |
| Sonicator | Qsonica | Q125 | |
| Trypan blue solution | Vetec | C.I. 23850 | |
| Vortex Genie 2 | Scientific Industries, Inc. | 0K-0500-902 | |
| xCELLigence Real-Time Cell Analysis (RTCA) DP (dual purpose) | Agilent | 380601050 | Product details: RTCA system composed of detection hardware, cell plates and software |
References
- Nauseef, W. M., Borregaard, N. Neutrophils at work. Nature Immunology. 15 (7), 602-611 (2014).
- Groeneweg, L., Hidalgo, A. Emerging roles of infiltrating granulocytes and monocytes in homeostasis. Cellular and Molecular Life Sciences. 77 (19), 3823-3830 (2020).
- Rosales, C., Lowell, C. A., Schnoor, M., Uribe-Querol, E. Neutrophils: their role in innate and adaptive immunity 2017. Journal of Immunology Research. 2017, 9748345 (2017).
- Castro, M., et al. Proteome analysis of resting human neutrophils. Protein & Peptide Letters. 13 (5), 481-487 (2006).
- Li, Y., et al. The regulatory roles of neutrophils in adaptive immunity. Cell Communication and Signaling. 17, 147 (2019).
- de Oliveira, S., Rosowski, E. E., Huttenlocher, A. Neutrophil migration in infection and wound repair: going forward in reverse. Nature Reviews Immunology. 16 (6), 378-391 (2016).
- Burn, G. L., Foti, A., Marsman, G., Patel, D. F., Zychlinsky, A. The neutrophil. Immunity. 54 (7), 1377-1391 (2021).
- El-Benna, J., et al. Priming of the neutrophil respiratory burst: role in host defense and inflammation. Immunological Reviews. 273 (1), 180-193 (2016).
- Castro, M. S., Cilli, E. M., Fontes, W. Combinatorial synthesis and directed evolution applied to the production of alpha-helix forming antimicrobial peptides analogues. Current Protein & Peptide Science. 7 (6), 473-478 (2006).
- Mihaila, A. C., et al. Transcriptional profiling and functional analysis of N1/N2 neutrophils reveal an immunomodulatory effect of S100A9-blockade on the pro-inflammatory N1 subpopulation. Frontiers in Immunology. 12, 708770 (2021).
- Kuhns, D. B., Priel, D. A. L., Chu, J., Zarember, K. A. Isolation and functional analysis of human neutrophils. Current Protocols in Immunology. 111 (1), 7-23 (2015).
- Paulíková, E., Kociková, A., Sabol, M. Modification of a panoptic method of staining isolated cells. Bratislavske Lekarske Listy. 94 (12), 638-640 (1993).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 111 (1), 1-3 (2015).
- Libério, M. S., et al. Anti-proliferative and cytotoxic activity of pentadactylin isolated from Leptodactylus labyrinthicus on melanoma cells. Amino Acids. 40 (1), 51-59 (2011).
- Cano, P. M., Vargas, A., Lavoie, J. P. A real-time assay for neutrophil chemotaxis. BioTechniques. 60 (5), 245-251 (2016).
- Stefanowicz-Hajduk, J., Adamska, A., Bartoszewski, R., Ochocka, J. R. Reuse of E-plate cell sensor arrays in the xCELLigence Real-Time Cell Analyzer. BioTechniques. 61 (3), 117-122 (2016).
- Björkstén, B., Nyström, K., Lindqvist, B. The nitroblue tetrazolium (NBT) test in endemic benign (epidemic) nephropathy. Acta Medica Scandinavica. 199 (1-6), 147-150 (1976).
- Aquino, E., et al. Proteomic analysis of neutrophil priming by PAF. Protein & Peptide Letters. 23 (2), 142-151 (2016).
- Blanter, M., Gouwy, M., Struyf, S. Studying neutrophil function in vitro: cell models and environmental factors. Journal of Inflammation Research. 14, 141-162 (2021).
- Hsu, A. Y., Peng, Z., Luo, H., Loison, F. Isolation of human neutrophils from whole blood and buffy coats. Journal of Visualized Experiments. (175), e62837 (2021).
- Moghadam, Z. M., Henneke, P., Kolter, J. From flies to men: ROS and the NADPH oxidase in phagocytes. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 628991 (2021).
- Pattan, S. S., Bhat, K. G., Pattar, G. D., Kuntagi, M. Comparison of three different techniques for isolation of neutrophils from blood and their utility in performing nitroblue tetrazolium test. International Journal of Basic and Applied Physiology. 8 (1), 41 (2019).
- Gooty, J. R., Shashirekha, A., Guntakala, V. R., Palaparthi, R. Estimation of phagocytic activity of polymorphonuclear leukocytes in chronic and aggressive periodontitis patients with nitroblue tetrazolium test. Journal of Indian Society of Periodontology. 23 (4), 316 (2019).
- Langer, S., et al. Clinical and laboratory profiles of 17 cases of chronic granulomatous disease in north India. Indian Journal of Hematology and Blood Transfusion. 37 (1), 45-51 (2021).
- Oualha, R., et al. Infection of human neutrophils with Leishmania infantum or Leishmania major strains triggers activation and differential cytokines release. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 9, 153 (2019).
- Zilinskas, J., Zekonis, J., Zekonis, G., Valantiejiene, A., Periokaite, R. The reduction of nitroblue tetrazolium by total blood in periodontitis patients and the aged. Stomatologijal. 9 (4), 105-108 (2007).
- Benov, L. Improved formazan dissolution for bacterial MTT assay. Microbiology Spectrum. 9 (3), e01637 (2021).
- Chen, Y., Junger, W. G. Measurement of oxidative burst in neutrophils. Methods in Molecular Biology. 844, 115-124 (2012).
- Richardson, M. P., Ayliffe, M. J., Helbert, M., Davies, E. G. A simple flow cytometry assay using dihydrorhodamine for the measurement of the neutrophil respiratory burst in whole blood: comparison with the quantitative nitrobluetetrazolium test. Journal of Immunological Methods. 219 (1-2), 187-193 (1998).
- Jancinová, V., et al. The combined luminol/isoluminol chemiluminescence method for differentiating between extracellular and intracellular oxidant production by neutrophils. Redox Report. 11 (3), 110-116 (2006).
- Nosál, R., et al. Pharmacological intervention with oxidative burst in human neutrophils. Interdisciplinary Toxicology. 10 (2), 56-60 (2017).
- Mol, S., et al. Efficient neutrophil activation requires two simultaneous activating stimuli. International Journal of Molecular Sciences. 22 (18), 10106 (2021).
- Schneider, L., et al. Flow cytometry evaluation of CD14/CD16 monocyte subpopulations in systemic sclerosis patients: a cross sectional controlled study. Advances in Rheumatology. 61 (1), 27 (2021).
- Akin, E., Pelen, N. N., Tiryaki, I. U., Yalcin, F. Parameter identification for gompertz and logistic dynamic equations. PLoS One. 15 (4), e0230582 (2020).
- Guy, J. B., et al. Evaluation of the cell invasion and migration process: A comparison of the video microscope-based scratch wound assay and the boyden chamber assay. Journal of Visualized Experiments. (129), e56337 (2017).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- de Bont, C. M., Koopman, W. J. H., Boelens, W. C., Pruijn, G. J. M. Stimulus-dependent chromatin dynamics, citrullination, calcium signalling and ROS production during NET formation. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Cell Research. 1865, 1621-1629 (2018).
- Masuda, S., et al. Measurement of NET formation in vitro and in vivo by flow cytometry. Cytometry Part A. 91 (8), 822-829 (2017).
- Zharkova, O., et al. A flow cytometry-based assay for high-throughput detection and quantification of neutrophil extracellular traps in mixed cell populations. Cytometry Part A. 95 (3), 268-278 (2019).
- Hosseinnejad, A., et al. DNase I functional microgels for neutrophil extracellular trap disruption. Biomaterials Science. 10 (1), 85-99 (2022).
- Chrysanthopoulou, A., et al. Neutrophil extracellular traps promote differentiation and function of fibroblasts. The Journal of Pathology. 233 (3), 294-307 (2014).
- Tong, M., Abrahams, V. M. Visualization and quantification of neutrophil extracellular traps. Methods in Molecular Biology. 2255, 87-95 (2021).
- Santana, C. J. C., et al. Biological properties of a novel multifunctional host defense peptide from the skin secretion of the chaco tree frog, boana raniceps. Biomolecules. 10 (5), 790 (2020).
- Murphy, M. P., et al. Guidelines for measuring reactive oxygen species and oxidative damage in cells and in vivo. Nature Metabolism. 4 (6), 651-662 (2022).
- Boero, E., et al. Use of flow cytometry to evaluate phagocytosis of staphylococcus aureus by human neutrophils. Frontiers in Immunology. 12, 635825 (2021).
- Karsten, C. B., et al. A versatile high-throughput assay to characterize antibody-mediated neutrophil phagocytosis. Journal of Immunological Methods. 471, 46-56 (2019).
- Smirnov, A., Solga, M. D., Lannigan, J., Criss, A. K. Using imaging flow cytometry to quantify neutrophil phagocytosis. Methods in Molecular Biology. 2087, 127-140 (2020).
