סדרה של טכניקות סינון לסקירה מהירה של פונקציית נויטרופיל
Summary
פרוטוקול זה כולל סדרה של בדיקות פונקציונליות נויטרופילים שישמשו כשיטת סינון לכיסוי פונקציות ממסלולי איתות שונים. הפרוטוקול כולל הערכה ראשונית ופשוטה של כדאיות התא, טוהר, ייצור מיני חמצן תגובתי, נדידה בזמן אמת, פגוציטוזה, והצעה ראשונית של מלכודות חוץ-תאיות של נויטרופילים.
Abstract
נויטרופילים ידועים כאחד מקווי ההגנה הראשונים בתגובה החיסונית המולדת ויכולים לבצע תפקודים תאיים מסוימים רבים, כגון כימוטקסיס, הגירה הפוכה, פגוציטוזה, פירוק אנזימים ציטוטוקסיים ומטבוליטים, ושחרור דנ”א כמלכודות חוץ-תאיות של נויטרופילים (NET). נויטרופילים לא רק יש איתות מוסדר היטב עצמם, אלא גם להשתתף ברגולציה של רכיבים אחרים של המערכת החיסונית. מכיוון שנויטרופילים טריים נבדלים זה מזה, קצרי חיים ומשתנים מאוד בין אנשים, חשוב להפיק את המרב מהדגימות שנאספו. חוקרים לעתים קרובות צריכים לבצע בדיקות סקר כדי להעריך סקירה כללית של פונקציות נויטרופילים רבים שעשויים להיות מושפעים מתנאים ספציפיים תחת הערכה. סדרה של בדיקות בעקבות תהליך בידוד יחיד של נויטרופילים בצפיפות נורמלית פותחה כדי לענות על צורך זה, בחיפוש אחר איזון בין מהירות, מקיף, עלות ודיוק. התוצאות יכולות לשמש כדי לנמק ולהנחות מחקרי מעקב מעמיקים. הליך זה יכול להתבצע בזמן ממוצע של 4 שעות וכולל הערכה של כדאיות התא, ייצור מיני חמצן תגובתי (ROS), נדידה בזמן אמת ופאגוציטוזה של שמרים על שקופיות זכוכית, מה שמשאיר מספיק תאים לגישות מפורטות יותר כמו מחקרי אומיקס. יתר על כן, ההליך כולל דרך לצפות בקלות בהצעה ראשונית של NETs לאחר צביעה פנאופטית מהירה שנצפתה במיקרוסקופ אור, עם היעדר סמנים ספציפיים, אם כי מספיק כדי לציין אם מאמצים נוספים בדרך זו יהיו כדאיים. מגוון הפונקציות שנבדקו משלב נקודות משותפות בין הבדיקות, ומקטין את זמן הניתוח וההוצאות. ההליך נקרא NeutroFun Screen, ולמרות שיש לו מגבלות, הוא מאזן את הגורמים הנ”ל. יתר על כן, מטרת עבודה זו אינה סט בדיקות מוגדר, אלא קו מנחה שניתן להתאים בקלות למשאבים ולדרישות של כל מעבדה.
Introduction
נויטרופילים הם תאי החיסון המולדים הנפוצים ביותר בדם האנושי וידועים כממלאים תפקיד מרכזי בזיהום ובדלקת, בהיותם המגיבים הראשונים שהגיעו לאתר של נזק לרקמות1. בשנים האחרונות גוברת ההכרה בתפקיד המכריע שממלאים נויטרופילים במגוון מחלות ובתמיכה בהומאוסטזיס2. נויטרופילים לא רק יש איתות מוסדר היטב עצמם, אלא גם להשתתף ברגולציה של רכיבים אחרים של המערכת החיסונית 3,4,5. לכן, חקירת נויטרופילים ותפקודיהם התאיים יוצאי הדופן הרבים, כגון כימוטקסיס, נדידה הפוכה6, פגוציטוזה7, התפרצות נשימתית8 ושחרור מלכודות נויטרופילים חוץ-תאיות (NETs)7, היא הכרחית בהקשרים מחקריים רבים שבהם יש צורך להעריך את השינויים הפונקציונליים, המורפולוגיים או המולקולריים הפוטנציאליים של נויטרופילים המופעלים על ידי תנאים ספציפיים הנבדקים.
נויטרופילים מבודדים טריים הם בעלי התמיינות סופנית, קצרי מועד, דינמיים מאוד ומופעלים בקלות9. עם זאת, שיטת אחסון יעילה שאינה משפיעה על תגובות הנויטרופילים טרם הושגה, מה שהופך את ביצוע בדיקות מרובות למאתגרות שחייבות להיות רצופות. יתר על כן, ניתוחים פונקציונליים10,11 שתוארו קודם לכן, המבוססים על בדיקות הדורשות ציטומטריה ו / או צביעה פלואורסצנטית, עשויים שלא להיות בחירה מעשית כאשר יש צורך בהערכה רחבה וראשונית של הנויטרופיל.
כדי לטפל בבעיות אלה, פרוטוקול זה מתאר סדרה של בדיקות שניתן לבצע לאחר תהליך בידוד יחיד, כולל הערכת כדאיות התא, ייצור מיני חמצן תגובתי (ROS), נדידה בזמן אמת ופאגוציטוזה של שמרי אפייה (Saccharomyces cerevisiae), שתוצאותיהם יכולות לשמש להנמקת מחקרי מעקב מעמיקים. הליך זה, שנקרא NeutroFun Screen, תוכנן להקיף את פעילויות האפקט המובילות, למעט degranulation, וניתן להשלים בזמן ממוצע של 4 שעות, כולל 1 שעה של הפעלה. בנוסף, התאים הנותרים יכולים לשמש לגישות מפורטות יותר כמו מחקרי אומיקס. יתרונה של שיטה זו טמון באיזון בין מהירות, מקיף, עלות ודיוק.
יתר על כן, יש דרך להתבונן בקלות בהצעה ראשונית של NETs, ללא סמנים ספציפיים, אך מספיק כדי לציין אם מאמצים נוספים בכיוון זה יהיו כדאיים. מגוון הפונקציות שנבדקו נועד לשלב נקודות משותפות בין המבחנים, ולצמצם את זמן הניתוח וההוצאות. המטרה העיקרית של שיטה זו היא לספק ניתוח מאוזן ופונקציונלי לגבי מהירות, מקיף, עלות ודיוק המאפשר סקירה כללית של תגובת הנויטרופילים, מה שהופך אותה לצעד ראשוני שימושי בחקירת ההשפעות של גירויים חדשים על נויטרופילים בצפיפות נורמלית.
Protocol
Representative Results
Discussion
נויטרופילים הם תאים דינמיים ומגיבים מאוד, קצרי חיים שעדיין לא ניתן לשמר אותםבהקפאה 19, מה שהופך את חקירת הביולוגיה שלהם למאתגרת. לכן, חיוני לעקוב אחר צעדים זהירים כדי להשיג נויטרופילים קיימא, מועשר ומנוחה11,20. במחקר זה נעשה שימוש בטכניקת בידוד מב?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים לסוכנויות המימון הבאות: FAPDF, CNPq, CAPES, UnB, FINEP ו-FINATEC.
Materials
| CIM-Plate 16 | Agilent | 5665825001 | |
| CLARIOstar Plate Reader | BMG LABTECH | US Patent Number 9,733,124 Product details: MARS Data Analysis Software |
|
| Dimethyl sulfoxide | Dinâmica | 1582 | |
| DNAse I | Sigma – Aldrich | DN 25 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Sigma – Aldrich | E5134 | |
| Fast panoptic stain | Laborclin | 620529 | |
| Glass slide | Exacta | 7102 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution with calcium, with magnesium, without phenol red. | Sigma – Aldrich | 55037C | |
| Hank’s Balanced Salt Solution without calcium chloride, magnesium sulfate and sodium bicarbonate. | Sigma – Aldrich | H4641 | |
| Heparin | Blau | 7896014655229 | |
| Laminar flow cabinet | Veco | VLFS-12 | |
| Microscope | Zeiss | 415501-0101-002 | Product details: Primostar 1 |
| Mixing Block | BIOER | MB-102 | |
| Neubauer improved bright-lined | New Optik | 1110000 | |
| N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine | Sigma – Aldrich | F3506 | |
| Nitroblue tetrazolium | Neon | CAS 298-83-9 | |
| Percoll | Cytiva | 17089101 | separation media |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma – Aldrich | P8139 | |
| Phosphate buffered saline tablet | Sigma – Aldrich | P4417 | |
| ROTOFIX 32 A | Hettich | 1206 | |
| Saccharomyces cerevisiae | Fleischmann | ||
| Safranin | Sigma – Aldrich | 50240 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Cytiva | 17-1313-01 | |
| Sonicator | Qsonica | Q125 | |
| Trypan blue solution | Vetec | C.I. 23850 | |
| Vortex Genie 2 | Scientific Industries, Inc. | 0K-0500-902 | |
| xCELLigence Real-Time Cell Analysis (RTCA) DP (dual purpose) | Agilent | 380601050 | Product details: RTCA system composed of detection hardware, cell plates and software |
References
- Nauseef, W. M., Borregaard, N. Neutrophils at work. Nature Immunology. 15 (7), 602-611 (2014).
- Groeneweg, L., Hidalgo, A. Emerging roles of infiltrating granulocytes and monocytes in homeostasis. Cellular and Molecular Life Sciences. 77 (19), 3823-3830 (2020).
- Rosales, C., Lowell, C. A., Schnoor, M., Uribe-Querol, E. Neutrophils: their role in innate and adaptive immunity 2017. Journal of Immunology Research. 2017, 9748345 (2017).
- Castro, M., et al. Proteome analysis of resting human neutrophils. Protein & Peptide Letters. 13 (5), 481-487 (2006).
- Li, Y., et al. The regulatory roles of neutrophils in adaptive immunity. Cell Communication and Signaling. 17, 147 (2019).
- de Oliveira, S., Rosowski, E. E., Huttenlocher, A. Neutrophil migration in infection and wound repair: going forward in reverse. Nature Reviews Immunology. 16 (6), 378-391 (2016).
- Burn, G. L., Foti, A., Marsman, G., Patel, D. F., Zychlinsky, A. The neutrophil. Immunity. 54 (7), 1377-1391 (2021).
- El-Benna, J., et al. Priming of the neutrophil respiratory burst: role in host defense and inflammation. Immunological Reviews. 273 (1), 180-193 (2016).
- Castro, M. S., Cilli, E. M., Fontes, W. Combinatorial synthesis and directed evolution applied to the production of alpha-helix forming antimicrobial peptides analogues. Current Protein & Peptide Science. 7 (6), 473-478 (2006).
- Mihaila, A. C., et al. Transcriptional profiling and functional analysis of N1/N2 neutrophils reveal an immunomodulatory effect of S100A9-blockade on the pro-inflammatory N1 subpopulation. Frontiers in Immunology. 12, 708770 (2021).
- Kuhns, D. B., Priel, D. A. L., Chu, J., Zarember, K. A. Isolation and functional analysis of human neutrophils. Current Protocols in Immunology. 111 (1), 7-23 (2015).
- Paulíková, E., Kociková, A., Sabol, M. Modification of a panoptic method of staining isolated cells. Bratislavske Lekarske Listy. 94 (12), 638-640 (1993).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 111 (1), 1-3 (2015).
- Libério, M. S., et al. Anti-proliferative and cytotoxic activity of pentadactylin isolated from Leptodactylus labyrinthicus on melanoma cells. Amino Acids. 40 (1), 51-59 (2011).
- Cano, P. M., Vargas, A., Lavoie, J. P. A real-time assay for neutrophil chemotaxis. BioTechniques. 60 (5), 245-251 (2016).
- Stefanowicz-Hajduk, J., Adamska, A., Bartoszewski, R., Ochocka, J. R. Reuse of E-plate cell sensor arrays in the xCELLigence Real-Time Cell Analyzer. BioTechniques. 61 (3), 117-122 (2016).
- Björkstén, B., Nyström, K., Lindqvist, B. The nitroblue tetrazolium (NBT) test in endemic benign (epidemic) nephropathy. Acta Medica Scandinavica. 199 (1-6), 147-150 (1976).
- Aquino, E., et al. Proteomic analysis of neutrophil priming by PAF. Protein & Peptide Letters. 23 (2), 142-151 (2016).
- Blanter, M., Gouwy, M., Struyf, S. Studying neutrophil function in vitro: cell models and environmental factors. Journal of Inflammation Research. 14, 141-162 (2021).
- Hsu, A. Y., Peng, Z., Luo, H., Loison, F. Isolation of human neutrophils from whole blood and buffy coats. Journal of Visualized Experiments. (175), e62837 (2021).
- Moghadam, Z. M., Henneke, P., Kolter, J. From flies to men: ROS and the NADPH oxidase in phagocytes. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 628991 (2021).
- Pattan, S. S., Bhat, K. G., Pattar, G. D., Kuntagi, M. Comparison of three different techniques for isolation of neutrophils from blood and their utility in performing nitroblue tetrazolium test. International Journal of Basic and Applied Physiology. 8 (1), 41 (2019).
- Gooty, J. R., Shashirekha, A., Guntakala, V. R., Palaparthi, R. Estimation of phagocytic activity of polymorphonuclear leukocytes in chronic and aggressive periodontitis patients with nitroblue tetrazolium test. Journal of Indian Society of Periodontology. 23 (4), 316 (2019).
- Langer, S., et al. Clinical and laboratory profiles of 17 cases of chronic granulomatous disease in north India. Indian Journal of Hematology and Blood Transfusion. 37 (1), 45-51 (2021).
- Oualha, R., et al. Infection of human neutrophils with Leishmania infantum or Leishmania major strains triggers activation and differential cytokines release. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 9, 153 (2019).
- Zilinskas, J., Zekonis, J., Zekonis, G., Valantiejiene, A., Periokaite, R. The reduction of nitroblue tetrazolium by total blood in periodontitis patients and the aged. Stomatologijal. 9 (4), 105-108 (2007).
- Benov, L. Improved formazan dissolution for bacterial MTT assay. Microbiology Spectrum. 9 (3), e01637 (2021).
- Chen, Y., Junger, W. G. Measurement of oxidative burst in neutrophils. Methods in Molecular Biology. 844, 115-124 (2012).
- Richardson, M. P., Ayliffe, M. J., Helbert, M., Davies, E. G. A simple flow cytometry assay using dihydrorhodamine for the measurement of the neutrophil respiratory burst in whole blood: comparison with the quantitative nitrobluetetrazolium test. Journal of Immunological Methods. 219 (1-2), 187-193 (1998).
- Jancinová, V., et al. The combined luminol/isoluminol chemiluminescence method for differentiating between extracellular and intracellular oxidant production by neutrophils. Redox Report. 11 (3), 110-116 (2006).
- Nosál, R., et al. Pharmacological intervention with oxidative burst in human neutrophils. Interdisciplinary Toxicology. 10 (2), 56-60 (2017).
- Mol, S., et al. Efficient neutrophil activation requires two simultaneous activating stimuli. International Journal of Molecular Sciences. 22 (18), 10106 (2021).
- Schneider, L., et al. Flow cytometry evaluation of CD14/CD16 monocyte subpopulations in systemic sclerosis patients: a cross sectional controlled study. Advances in Rheumatology. 61 (1), 27 (2021).
- Akin, E., Pelen, N. N., Tiryaki, I. U., Yalcin, F. Parameter identification for gompertz and logistic dynamic equations. PLoS One. 15 (4), e0230582 (2020).
- Guy, J. B., et al. Evaluation of the cell invasion and migration process: A comparison of the video microscope-based scratch wound assay and the boyden chamber assay. Journal of Visualized Experiments. (129), e56337 (2017).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- de Bont, C. M., Koopman, W. J. H., Boelens, W. C., Pruijn, G. J. M. Stimulus-dependent chromatin dynamics, citrullination, calcium signalling and ROS production during NET formation. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Cell Research. 1865, 1621-1629 (2018).
- Masuda, S., et al. Measurement of NET formation in vitro and in vivo by flow cytometry. Cytometry Part A. 91 (8), 822-829 (2017).
- Zharkova, O., et al. A flow cytometry-based assay for high-throughput detection and quantification of neutrophil extracellular traps in mixed cell populations. Cytometry Part A. 95 (3), 268-278 (2019).
- Hosseinnejad, A., et al. DNase I functional microgels for neutrophil extracellular trap disruption. Biomaterials Science. 10 (1), 85-99 (2022).
- Chrysanthopoulou, A., et al. Neutrophil extracellular traps promote differentiation and function of fibroblasts. The Journal of Pathology. 233 (3), 294-307 (2014).
- Tong, M., Abrahams, V. M. Visualization and quantification of neutrophil extracellular traps. Methods in Molecular Biology. 2255, 87-95 (2021).
- Santana, C. J. C., et al. Biological properties of a novel multifunctional host defense peptide from the skin secretion of the chaco tree frog, boana raniceps. Biomolecules. 10 (5), 790 (2020).
- Murphy, M. P., et al. Guidelines for measuring reactive oxygen species and oxidative damage in cells and in vivo. Nature Metabolism. 4 (6), 651-662 (2022).
- Boero, E., et al. Use of flow cytometry to evaluate phagocytosis of staphylococcus aureus by human neutrophils. Frontiers in Immunology. 12, 635825 (2021).
- Karsten, C. B., et al. A versatile high-throughput assay to characterize antibody-mediated neutrophil phagocytosis. Journal of Immunological Methods. 471, 46-56 (2019).
- Smirnov, A., Solga, M. D., Lannigan, J., Criss, A. K. Using imaging flow cytometry to quantify neutrophil phagocytosis. Methods in Molecular Biology. 2087, 127-140 (2020).
