여기에 제시된 것은 3차원 형광 현미경을 사용한 유충 제브라피쉬의 생체 내 전뇌 이미징을 위한 프로토콜입니다. 실험 절차에는 샘플 준비, 이미지 획득 및 시각화가 포함됩니다.
척추동물 모델 동물인 제브라피쉬 유충은 신경과학에서 널리 사용되며 세포 분해능에서 전뇌 활동을 모니터링할 수 있는 독특한 기회를 제공합니다. 여기에서는 샘플 준비 및 고정화, 샘플 임베딩, 이미지 획득 및 이미징 후 시각화를 포함하여 3차원 형광 현미경을 사용하여 유충 제브라피쉬의 전뇌 이미징을 수행하기 위한 최적화된 프로토콜을 제공합니다. 현재 프로토콜은 컨포칼 현미경과 맞춤형으로 설계된 형광 현미경을 사용하여 1시간 이상 세포 분해능으로 유충 제브라피쉬 뇌의 구조와 신경 활동을 생체 내 이미징할 수 있습니다. 샘플 장착 및 위치 지정, 아가로스 겔의 기포 형성 및 먼지 방지, 아가로스 겔의 불완전한 응고 및 물고기의 마비로 인한 이미지의 움직임 방지를 포함하여 프로토콜의 중요한 단계도 논의됩니다. 프로토콜은 여러 설정에서 검증 및 확인되었습니다. 이 프로토콜은 애벌레 제브라 피쉬의 다른 기관을 이미징하는 데 쉽게 적용 할 수 있습니다.
제브라피쉬(Danio rerio)는 애벌레 단계의 광학적 투명성, 빠른 발달, 낮은 유지 관리 비용 및 다양한 유전 도구의 가용성으로 인해 신경과학에서 모델 척추동물로 널리 채택되었습니다 1,2,3,4. 특히, 생물학적 사건 5,6,7,8,9의 유전적으로 암호화된 형광 리포터와 결합된 유충의 광학적 투명성은 전뇌 수준(10,11,12,13,14)에서 뉴런 활동과 구조 모두를 이미지화할 수 있는 독특한 기회를 제공한다 . 그러나 세포 해상도를 지원하는 현미경을 사용하더라도 획득한 이미지가 반드시 단일 세포 수준에서 정보를 유지하는 것은 아닙니다. 광학 이미지 품질은 샘플 장착에 사용되는 아가로스 겔에 의해 도입된 수차로 인해 저하될 수 있고, 물고기는 비스듬히 장착될 수 있으며, 따라서 관심 영역은 현미경의 시야 내에 완전히 포함되지 않으며, 물고기는 기록 중에 움직여 이미지에서 모션 아티팩트를 유발하거나 이미지로부터 정확한 신호 추출을 방해할 수 있습니다.
따라서 최소한의 노이즈와 모션으로 고품질 이미지 데이터를 획득하기 위해서는 효과적이고 재현 가능한 프로토콜이 필요합니다. 불행하게도, 생체 내 유충 제브라피쉬의 전체 뇌를 이미징하기 위해 공개적으로 이용 가능한 프로토콜 15,16,17,18,19는 절차를 간략하게 설명할 뿐이며, 아가 로스 응고, 정확한 장착 기술 및 집게를 사용한 샘플 위치 지정과 같은 세부 사항의 상당 부분을 각 실험자에게 맡깁니다. 또한, 아가로스 농도 및 고정화 방법(10,11,14,15,16,17,18,19)의 불일치는 이미징 공정 동안 물고기 이동으로부터 발생하는 문제를 야기할 수 있다.
여기에서는 3차원 형광 현미경을 사용한 유충 제브라피쉬의 전뇌 이미징을 위한 자세한 프로토콜이 제공됩니다. 그림 1 은 프로토콜에 대한 그래픽 개요를 제공합니다: 시료 전처리 및 고정화, 시료 임베딩, 이미지 획득, 이미징 후 시각화. 생체 내에서 유충 제브라피쉬 뇌의 구조적 및 기능적 이미징은 상업용 컨포칼 현미경과 맞춤형으로 설계된 형광 현미경을 사용하여 시연됩니다. 이 프로토콜은 실험 요구 및 설계에 따라 특정 감각 자극 또는 행동 맥락을 가진 뇌 영상을 위해 실무자가 조정할 수 있습니다.
현재 프로토콜은 장기간(예: 1시간 이상)에 걸쳐 유충 제브라피쉬의 생체 내 전뇌 이미징과 획득한 구조 및 기능 이미징 데이터의 시각화를 가능하게 합니다.
가장 중요한 단계는 시료 마운팅 및 위치 지정입니다. 시료 포매 중에는 기포 형성을 방지하고 아가로스 겔의 먼지를 방지하는 것이 중요합니다. 젤에 기포와 먼지가 포함되어 있으면 화질이 심각하게 저하될 수 있습니다. 집게를 사용하여 샘플을 배치하는 동안 샘플이 수평 및 수직으로 수평인지 확인하는 것이 중요합니다. 그렇지 않으면 관심 영역이 현미경의 시야 내에 포함되지 않을 수 있습니다. 또한, 이러한 포지셔닝은 아가로스 겔의 고형화 전에 짧은 시간 내에 이루어져야 하며, 이러한 손상은 이미지 품질을 손상시키기 때문에 표면에 손상을 입히는 것을 방지해야 합니다.
또 다른 주요 과제는 아가로스 겔의 불완전한 응고(그림 6)와 제브라피쉬의 마비로 인한 이미지의 움직임을 피하는 것입니다. 아고르스 겔이 완전히 응고되기 전에 계란 물을 샘플에 첨가하면 물고기는 측면 및 축 방향으로 천천히 움직여 시계열 이미지에서 샘플 드리프트로 나타납니다(그림 6A). 마비제의 투여량이 충분하지 않거나 효과의 지속 시간이 끝나면, 검체가 움직이려고 시도할 수 있으며, 이는 타임랩스 영상에서 빠른 경련으로 나타난다.
모션 아티팩트 없이 고품질 이미지를 획득하기 위한 전술한 단계들의 중요성에도 불구하고, 공개적으로 이용가능한 프로토콜들(15,16,17,18,19)은 실험 절차의 간략한 개요만을 제공하며, 이러한 세부사항들은 결여되어 있다. 예를 들어, 고정화 프로토콜(11)이 없는 획득된 이미지들은 다운스트림 이미지 분석을 어렵게 만드는 실질적인 모션 아티팩트들을 겪는다. 아가로스 겔 응고 및 샘플 마비와 같은 필수 구성 요소를 통합함으로써 당사의 프로토콜은 모션 아티팩트를 최소화하면서 획득한 이미지 품질의 일관성을 크게 향상시킵니다.
요약하면, 유충 제브라피쉬 뇌의 생체 내 이미징을 위한 최적화되고 재현 가능한 실험 절차가 설명됩니다. 뇌 활동 및 구조의 생체 내 이미징을 위한 이 프로토콜의 타당성 및 재현성은 다중 설정 14,18,29,30,31에서 확인되었습니다. 현재 작업 흐름은 유충 제브라피쉬의 전뇌 이미징에 초점을 맞추었지만 애벌레 제브라피쉬의 다른 기관 이미징에도 쉽게 적용할 수 있습니다35,36.
The authors have nothing to disclose.
칼슘 이미징에 사용된 제브라피쉬 계통은 한국의 제브라피쉬 질병 모델링 센터(ZCDM)에서 제공했습니다. 본 연구는 한국연구재단(2020R1C1C1009869, NRF2021R1A4A102159411, RS-2023-00209473)의 지원을 받았다.
1.5 mL microcentrifuge tube | SciLab | SL.Tub3513 | To aliquot agarose gel and pancuronium bromide solution |
15 mL Falcon tubes | Falcon | 352096 | To prepare agarose gel and pancuronium bromide solution |
16× 0.8NA water dipping objective lens | Nikon | CFI75 LWD 16×W | Objective lens for whole-brain imaging |
1-phenyl 2-thiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629-10G | 200 μM of 1-phenyl 2-thiourea (PTU) |
50 mL Falcon tubes | Falcon | 352070 | To prepare egg water |
Disposable transfer pipette | SciLab | SL.Pip3032 | To transfer zebrafish larvae |
Egg water | N/A | N/A | 0.6 g sea salt in 10 L deionized water |
Forceps | Karl Hammacher GmbH | HSO 010-10 | Forceps used for sample positioning |
Low melting point agarose | Thermo Scientific | R0801 | 2% (wt/vol) agarose gel |
Napari | Napari | N/A | To visualize microscopy images in 3-D |
NIS-Elements C | Nikon | N/A | Imaging software for confocal microscope |
Pancuronium bromide | Sigma-Aldrich | P1918-10MG | 0.25 mg/mL of pancuronium bromide solution |
Petri dish, 35 mm | SPL Life Sciences | 11035 | Petri dish used for sample embedding |
Petri dish, 55 mm | SPL Life Sciences | 11050 | To prepare zebrafish larvae after screening |
Point-scanning confocal microscopy system (C2 Plus) | Nikon | N/A | Confocal microscope for whole-brain imaging |
Sea salt | Sigma-Aldrich | S9883-500G | Sea salt used for preparing egg water |