インビボ 3次元蛍光顕微鏡を用いたゼブラフィッシュ幼生の全脳イメージング

すべてのゼブラフィッシュ実験は、KAIST(KA2021-125)の施設動物管理使用委員会(IACUC)によって承認されました。カルシウム指標GCaMP7a[Tg(huc:GAL4)]の全神経細胞発現を有する合計12匹の成体ゼブラフィッシュ;Tg(UAS:GCaMP7a)]をキャスパー[mitfa(w2/w2);mpv17(a9/a9)]バックグラウンドで育種に用いた。このグループは、8人の女性と4人の男性で構成され、年齢は3か月から12か月までさまざまでした。ゼブラフィッシュ仔魚の画像実験は、受精後3〜4日(d.p.f.)に行われました。 1. ゼブラフィッシュサンプル調製 Tg(huc:GAL4)などの所望のトランスジェニック系統の成魚を繁殖させた後に胚を収集する。Tg(UAS:GCaMP7a)20,21,22、卵水で満たされたペトリ皿(材料の表を参照)。胚を28°Cのインキュベーターに入れ、3〜4 d.p.f.幼虫23、24、25に上げます。ゼブラフィッシュの背景がアルビノでない場合、色素沈着の形成を抑制するために、受精後24時間(h.p.f.)で胚を200μMの1-フェニル2-チオ尿素(PTU;材料表を参照)を含む卵水で満たされたペトリ皿に移します25,26。24時間ごとに、200μMのPTUを含む新鮮な卵水で魚を新しい皿に移します。注:ゼブラフィッシュは、28°Cと14:10時間の明暗サイクルで標準条件下で維持されます。PTU治療は、ゼブラフィッシュの幼虫の行動と甲状腺機能に影響を与えることが知られています27,28。したがって、PTUは注意して使用し、実験では潜在的な交絡因子を注意深く制御することが重要です。 目的の蛍光タンパク質(汎ニューロンGCaMP7aなど)を発現するサンプルを見つけるには、落射蛍光顕微鏡でサンプルをスクリーニングし、明るい発現を持つサンプルを選択します。 選択した3〜4 d.p.f.卵水で満たされたペトリ皿でゼブラフィッシュサンプルを準備します(図2A)。注:自発的な神経活動を記録するには、80 h.p.f.より前の自発的活動のレベルが低く、色素沈着の発達は、キャスパーの背景があっても100 h.p.f.後に画質が低下する可能性があるため、80〜100 h.p.f.の間のサンプルを使用することをお勧めします。 10 mLの卵水に1 mLの2.5 mg / mLストック溶液(材料の表を参照)を加えて、0.25 mg / mLの臭化パンクロニウム溶液14,19、29、30、31を準備します。臭化パンクロニウム溶液を1.5 mLの微量遠心チューブに分注します。 事前にスクリーニングしたサンプルをトランスファーピペットを使用してペトリ皿に移します。注意: サンプルと一緒に最小量の卵水を持ち越すようにしてください。 0.1 mLの臭化パンクロニウム溶液を麻痺のためにペトリ皿に移します。注:臭化パンクロニウムは、ゼブラフィッシュの幼虫の神経活動に潜在的な減衰効果があります32。臭化パンクロニウムへの曝露の濃度と期間を慎重に検討することが不可欠です。 2. 2%(wt/vol)アガロースゲル調製 ヒートブロックの電源を入れ、目標温度を37°Cに設定します。 ユニットが熱くなり、設定温度で平衡化するのを待ちます。 0.2 gの低融点アガロース粉末( 材料の表を参照)を10 mLの卵水に溶解します。 アガロース溶液を電子レンジで加熱し、アガロースが完全に溶解するまで振とうしてボルテックスして混合します。 アガロースゲルを1.5 mLの微量遠心チューブに分注し、マイクロ遠心チューブをヒートブロックに保管します(図2B)。注意: アガロースゲルの気泡が消えたかどうかを確認してください。 3. サンプルの取り付けと位置決め 実体顕微鏡でサンプルをチェックして、幼虫の動きが止まったことを確認し、心拍をチェックしてサンプルの健康状態を視覚的に評価します(図2C)。ハートビートが遅すぎる場合は、サンプルを破棄します。注:画像化されている魚の心拍が遅すぎる場合(たとえば、毎分60拍未満)、長期間の画像化を実行できない場合があります。魚の健康状態を評価するために、心拍数は同じペトリ皿内の他の魚と比較することによって視覚的にチェックすることができます。これは、画像化される魚が画像化手順に十分健康で安定していることを確認するのに役立ちます。 トランスファーピペットを使用して、1匹のゼブラフィッシュを1.5 mLマイクロ遠心チューブ内のアガロースゲルに入れます(図2D)。注意: サンプルを移した後は、必ずピペットを廃棄してください。 アガロースゲルをペトリ皿に注ぎ、1〜2 mmのコートを作ります。トランスファーピペットを使用して微量遠心チューブ内のサンプルをペトリ皿に移し、幼虫を皿の中央に置きます。注意: アガロースゲルにほこりや気泡がある場合は、トランスファーピペットを使用してそれらを取り除きます。 鉗子を使用して、頭と尾が平らになるようにサンプルを目的の方向に配置します(図2E)。 両目が水平になるように鉗子を使用してサンプルを回転させます(図2F)。注意: アガロースゲルが固化し始める前に、位置合わせ手順(位置と回転)を完了する必要があります。 アライメント後、アガロースゲルが固まるまで待ちます(図2G、H)。注:アガロースゲルが固化するまでの待ち時間は、ゲルの容量とサイズに応じて、5〜10分の範囲です。 アガロースゲルを固化させた後、シャーレに卵水を入れ、サンプルを埋め込んだシャーレを顕微鏡ステージに置きます(図2I)。 4. 画像取得 顕微鏡システム(レーザー、共焦点コントローラー、顕微鏡、コンピューターなど、 材料表を参照)の電源を入れ、システム全体が機能していることを確認します。 低倍率の対物レンズを選択し、視野の中央にサンプルを配置します。 適切な倍率の水浸または水浸対物レンズを選択します(例:16x 0.8開口数(NA)水浸レンズ; 材料表を参照)。視野を微調整します。 画像取得ソフトウェアを使用して、イメージングパラメータ(画像サイズ、レーザー出力、露光時間、フレーム数など)を設定します。注意: 特定のニーズに対して可能な限り最良の結果が得られるようにイメージングパラメータを設定します(代表的な結果セクションの画像取得のセットアップを参照してください)。画像が飽和している場合は、レーザー出力を下げます。 ステージを動かしてサンプルの脳を見つけ、焦点面を手動で上下に変更することにより、ソフトウェアのライブビューモードを使用してその厚さを決定します。音量の下限と上限を設定します。注意: 脳全体が横方向と軸方向の両方に沿って視野に含まれていることを確認してください。 顕微鏡の軸方向分解能を考慮してzステップサイズを設定します。注:ゼブラフィッシュの幼虫の脳をイメージングするのに最適なzステップサイズは、イメージングモダリティと顕微鏡の解像度によって異なります。一例として、ライトシートの厚さとセル本体10の平均直径を考慮して、5μmのzステップサイズを使用した。 設定した視野の画像取得を進めます。体積構造イメージングでは、焦点面を変えて各z面の2次元画像を順次取得することで、脳全体の3次元画像(x,y,z)を取得します。 単一のz平面の機能イメージングでは、特定の深さでの脳の神経活動の時系列画像(x、y、t)を取得します。 体積機能イメージングでは、3次元画像を順次取得することにより、脳全体の神経活動の4次元画像(x,y,z,t)を取得します。メモ: コンピュータの使用可能なメモリサイズを考慮してフレーム数を設定します。臭化パンクロニウムの効果の持続時間のために、1時間未満の取得時間が推奨される。 画像を取得した後、結果を保存し、画像分析のためにイメージングパラメータ(ピクセルサイズ、zステップサイズ、フレームレート、レーザーパワーなど)を記録します。 データのレンダリングと画像解析に適した形式で画像をエクスポートします。注: タグ付きイメージ ファイル (TIF) 形式のイメージをエクスポートすることをお勧めします。TIFは可逆画像圧縮をサポートし、ほとんどの画像処理ソフトウェアおよびプログラミング言語と互換性があります。さらに、TIF形式は、取得パラメータ、画像解像度、およびデータの解釈と再現性に役立つその他の関連情報などのメタデータの組み込みをサポートしています。 5. napari を使用したビジュアライゼーションのセットアップ 注:napariは、グラフィックスプロセッシングユニット(GPU)ベースのレンダリング33を備えたPython環境におけるオープンソースの多次元画像ビューアです。ナパリアニメーションプラグインは、プログラムによる映画の作成を提供します。フィルタリングや幾何学的変換などの汎用画像処理には、オープンソースの画像処理プログラムであるFijiを使用することをお勧めします( 材料表を参照)。napari を使用したビジュアライゼーションに使用したソースコードは、GitHub (https://github.com/NICALab/Zebrafish-brain-visualization) で入手できます。 pipまたはcondaのいずれかを使用してナパリとナパリアニメーションをインストールします。インストール後、新しい jupyter ノートブック ファイルを作成します。注: Python スクリプトよりも、Python 用の対話型ツールである jupyter ノートブックで実行することをお勧めします。 ナパリとナパリアニメーションをインポートします。 6. ナパリを使った構造物の可視化 レンダリングされたゼブラフィッシュの脳の画像を視覚化し、ムービーを作成するには、3-D 画像 (x、y、z) を読み込み、napari ウィンドウを開きます。ナパリアニメーションプラグインを接続します(図3A)。 ボクセル サイズ、カラーマップ、コントラスト制限などのパラメーターをレイヤー コントロールに設定します。 キャンバスでビューアの設定(遠近法、角度など)を調整します。 レンダリング イメージをキャプチャするには、アニメーション ウィザードで キャプチャ ボタンを押します。 レンダリングされたボリュームのムービーを生成するには、ビューアの設定を変更し、キーフレームを追加します(図3B)。 キーフレームを追加した後、アニメーションウィザードでキーフレーム間のフレーム数(ステップ)を設定します。レンダリングされたアニメーションを保存します。 7. napariを用いた神経活動の画像処理と可視化 注:神経活動の時系列画像を静的な背景と活動のオーバーレイ画像として視覚化するには、分解アルゴリズムを生の画像に適用する必要があります。BEAR24 と呼ばれる分解アルゴリズムの MATLAB 実装を使用します。BEARのMATLABバージョンはGitHub(https://github.com/NICALab/BEAR)で入手できます。 静的な背景とニューロンの活動を分解するには、生の時系列画像(x、y、tまたはx、y、z、t)にBEARを適用します。分解後、背景と神経活動の画像をTIFファイルとして保存します(図3C)。 背景画像と神経活動画像を読み込み、napariウィンドウを開きます。ナパリアニメーションプラグインを接続します。 背景画像にはグレーのカラーマップを使用し、ニューロン活動画像にはホットカラーマップを使用します(図3C)。 レイヤーコントロールで不透明度やコントラスト制限などのパラメーターを設定します。 ニューロン活動のムービーを生成するには、ビューアの設定を変更し、キーフレームを追加してアニメーションをレンダリングします。 キーフレームを追加した後、アニメーションウィザードでキーフレーム間のフレーム数(ステップ)を設定します。レンダリングされたアニメーションを保存します。