JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
русский

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neuroscience

В естественных условиях Визуализация всего мозга личинок рыбок данио-рерио с использованием трехмерной флуоресцентной микроскопии

Published: April 28, 2023
doi:
10.3791/65218
, , , , , ,
1School of Electrical Engineering,KAIST, 2Department of Biology,Chungnam National University, 3KAIST Institute for Health Science and Technology

Summary

Здесь представлен протокол визуализации всего мозга личинок рыбок данио-рерио in vivo с использованием трехмерной флуоресцентной микроскопии. Экспериментальная процедура включает в себя подготовку образцов, получение изображений и визуализацию.

Abstract

В качестве модельного животного позвоночных личинки рыбок данио-рерио широко используются в нейробиологии и предоставляют уникальную возможность контролировать активность всего мозга при клеточном разрешении. Здесь мы предлагаем оптимизированный протокол для выполнения визуализации всего мозга личинок рыбок данио-рерио с использованием трехмерной флуоресцентной микроскопии, включая подготовку и иммобилизацию образцов, встраивание образцов, получение изображений и визуализацию после визуализации. Текущий протокол позволяет in vivo визуализировать структуру и активность нейронов мозга личинок рыбок данио-рерио с клеточным разрешением в течение более 1 часа с использованием конфокальной микроскопии и специально разработанной флуоресцентной микроскопии. Также обсуждаются критические шаги в протоколе, включая установку и позиционирование образца, предотвращение образования пузырьков и пыли в агарозном геле, а также предотвращение движения на изображениях, вызванного неполным затвердеванием агарозного геля и параличом рыбы. Протокол был проверен и подтвержден в нескольких настройках. Этот протокол может быть легко адаптирован для визуализации других органов личинок рыбок данио.

Introduction

Рыбки данио-рерио (Danio rerio) широко используются в качестве образцовых позвоночных животных в неврологии благодаря своей оптической прозрачности на личиночной стадии, быстрому развитию, низким затратам на техническое обслуживание и наличию разнообразных генетических инструментов 1,2,3,4. В частности, оптическая прозрачность личинок в сочетании с генетически кодируемыми флуоресцентными репортерами биологических событий 5,6,7,8,9 дает уникальную возможность визуализировать как активность нейронов, так и структуру на уровне всего мозга 10,11,12,13,14 . Однако даже при использовании микроскопа, поддерживающего клеточное разрешение, полученные изображения не обязательно сохраняют информацию на уровне отдельных клеток; Качество оптического изображения может быть ухудшено из-за аберрации, вносимой агарозным гелем, используемым для монтажа образца, рыба может быть установлена под углом, таким образом, области интереса не полностью содержатся в поле зрения микроскопа, и рыба может двигаться во время записи, вызывая артефакты движения на изображениях или препятствуя точному извлечению сигнала из изображений.

Таким образом, необходим эффективный и воспроизводимый протокол для получения высококачественных данных изображения с минимальным шумом и движением. К сожалению, общедоступные протоколы визуализации всего мозга личинок рыбок данио-рерио in vivo 15,16,17,18,19 лишь кратко описывают процедуру, оставляя существенные части деталей, таких как затвердевание агарозы, точные методы монтажа и позиционирование образца с помощью щипцов, на усмотрение каждого экспериментатора. Кроме того, несоответствия в методах концентрации агарозы и иммобилизации 10,11,14,15,16,17,18,19 могут привести к проблемам, возникающим при движении рыбы в процессе визуализации.

Здесь представлен подробный протокол визуализации всего мозга личинок рыбок данио-рерио с использованием трехмерной флуоресцентной микроскопии. На рисунке 1 представлен графический обзор протокола: подготовка и иммобилизация образцов, встраивание образцов, получение изображений и визуализация после визуализации. Структурная и функциональная визуализация мозга личинок рыбок данио-рерио in vivo демонстрируется с использованием коммерческого конфокального микроскопа и специально разработанного флуоресцентного микроскопа. Этот протокол может быть адаптирован практиками для визуализации мозга с определенными сенсорными стимулами или контекстами поведения в зависимости от экспериментальных потребностей и дизайна.

Protocol

Все эксперименты с рыбками данио-рерио были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) KAIST (KA2021-125). Всего 12 взрослых рыбок данио-рерио с паннейрональной экспрессией индикатора кальция GCaMP7a [Tg(huc:GAL4); Для разведения использовались Tg(UAS:GCaMP7a)] на фоне каспера [mitfa(w2/w2);mpv17(a9/a9)]. Эта группа состояла из восьми самок и четырех самцов в возрасте от 3 до 12 месяцев. Эксперименты с визуализацией были проведены на личинках рыбок данио-рерио через 3-4 дня после оплодотворения (d.p.f.), стадии, в течение которой их пол не может быть определен. 1. Подготовка образцов рыбок данио-рерио Собирают эмбрионы после разведения взрослых рыб желаемой трансгенной линии, таких как Tg (huc: GAL4); Tg(UAS:GCaMP7a)20,21,22, в чашке Петри, наполненной яичной водой (см. Таблицу материалов). Поместите эмбрионы в инкубатор при температуре 28 °C и вырастите их до 3-4 д..ф. личинок23,24,25.Если фон рыбок данио-рерио не альбинос, чтобы подавить образование пигментации, перенесите эмбрионы через 24 ч после оплодотворения (h.p.f.) в чашку Петри, наполненную яичной водой, содержащей 200 мкМ 1-фенил-2-тиомочевины (PTU; см. Таблицу материалов)25,26. Каждые 24 часа перекладывайте рыбу в новую посуду со свежей яичной водой, содержащей 200 мкМ ПТУ.ПРИМЕЧАНИЕ: Рыбки данио-рерио содержатся в стандартных условиях при 28 ° C и 14:10 ч светлый: темный. Известно, что лечение PTU влияет на поведение и функцию щитовидной железы личинок рыбок данио-рерио27,28. Поэтому важно использовать PTU с осторожностью и тщательно контролировать потенциальные мешающие факторы в любых экспериментах. Чтобы найти образец, экспрессирующий интересующие флуоресцентные белки (например, паннейрональный GCaMP7a), проведите скрининг образца под эпифлуоресцентным микроскопом и выберите образец с яркой экспрессией. Подготовьте отобранный образец рыбок данио-рерио 3-4 д..ф. в чашке Петри, наполненной яичной водой (рис. 2А).ПРИМЕЧАНИЕ: Для регистрации спонтанной активности нейронов рекомендуется использовать образцы в возрасте от 80 до 100 л.с., так как уровень спонтанной активности низок до 80 л.с., а развитие пигментации, даже на фоне Каспера, может ухудшить качество изображения после 100 л.с. Приготовьте 0,25 мг/мл раствора бромида панкурония 14,19,29,30,31, добавив 1 мл исходного раствора 2,5 мг/мл (см. Таблицу материалов) к 10 мл яичной воды. Аликвотируйте раствор бромида панкурония в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл. Перенесите предварительно просеянный образец в чашку Петри с помощью трансферной пипетки.ПРИМЕЧАНИЕ: Постарайтесь взять с собой минимальный объем яичной воды. Перенесите 0,1 мл раствора бромида панкурония в чашку Петри для паралича.ПРИМЕЧАНИЕ: Бромид панкурония оказывает потенциальное демпфирующее действие на нейронную активность личинок рыбокданио-рерио 32. Важно тщательно учитывать концентрацию и продолжительность воздействия бромида панкурония. 2. Приготовление 2% (мас./об.) агарозного геля Включите тепловой блок и установите целевую температуру на 37 °C. Подождите, пока устройство нагреется и уравновесится при заданной температуре. Растворите 0,2 г порошка агарозы с низкой температурой плавления (см. Таблицу материалов) в 10 мл яичной воды. Нагрейте раствор агарозы в микроволновой печи и перемешайте его, встряхивая и взбалтывая, пока агароза полностью не растворится. Аликвотируйте агарозный гель в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл и храните микроцентрифужные пробирки на тепловом блоке (рис. 2B).ПРИМЕЧАНИЕ: Проверьте, не исчезли ли пузырьки в агарозном геле. 3. Монтаж и позиционирование образца Проверьте образец под стереомикроскопом, чтобы убедиться, что движение личинок прекратилось, и визуально оценить здоровье образца, проверив его сердцебиение (рис. 2C). Если сердцебиение слишком медленное, выбросьте образец.ПРИМЕЧАНИЕ: Если сердцебиение рыбы, получающей изображение, слишком медленное (например, ниже 60 ударов в минуту), может оказаться невозможным выполнить долгосрочную визуализацию. Чтобы оценить самочувствие рыбы, частоту сердечных сокращений можно визуально проверить, сравнив ее с другими рыбами в той же чашке Петри. Это поможет убедиться, что рыба, которую визуализируют, здорова и достаточно стабильна для процедуры визуализации. Используя пипетку для переноса, поместите одну личинку рыбки данио-рерио в агарозный гель в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл (рис. 2D).ПРИМЕЧАНИЕ: Обязательно выбросьте пипетку после переноса образца. Налейте агарозный гель в чашку Петри, чтобы получился слой толщиной 1-2 мм. Перенесите образец из микроцентрифужных пробирок в чашку Петри с помощью пипетки для переноса так, чтобы личинка была помещена в центр чашки.ПРИМЕЧАНИЕ: Если в агарозном геле есть пыль и пузырьки, удалите их с помощью пипетки для переноса. Используйте щипцы, чтобы расположить образец в желаемой ориентации так, чтобы голова и хвост были плоскими (рис. 2E). Поверните образец с помощью щипцов так, чтобы оба глаза были на одном уровне (рис. 2F).ПРИМЕЧАНИЕ: Процедуры выравнивания (положение и вращение) должны быть завершены до того, как агарозный гель начнет затвердевать. После выравнивания подождите, пока агарозный гель застынет (рис. 2G, H).ПРИМЕЧАНИЕ: Время ожидания затвердевания агарозного геля может составлять от 5 до 10 минут, в зависимости от объема и размера геля. После застывания агарозного геля наполните чашку Петри яичной водой и поместите чашку Петри со встроенным образцом на столик микроскопа (рис. 2I). 4. Получение изображения Включите систему микроскопа (например, лазеры, конфокальные контроллеры, микроскоп и компьютер; см. Таблицу материалов) и убедитесь, что вся система работает. Выберите объектив с малым увеличением и расположите образец в центре поля зрения. Выберите объектив с погружением в воду или погружение в воду с правильным увеличением (например, объектив с числовой апертурой 16x 0,8 (NA); см. Таблицу материалов). Внесите точные коррективы в поле зрения. Установите параметры изображения (например, размер изображения, мощность лазера, время экспозиции, количество кадров) с помощью программного обеспечения для получения изображений.ПРИМЕЧАНИЕ: Установите параметры визуализации для достижения наилучших возможных результатов для конкретных нужд (см. настройку для получения изображений в разделе репрезентативных результатов). Если изображение насыщенное, уменьшите мощность лазера. Найдите мозг образца, перемещая предметный столик, и определите его толщину в режиме просмотра в реальном времени в программном обеспечении, изменяя фокальные плоскости вручную вверх и вниз. Установите нижнюю и верхнюю границы громкости.ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что весь мозг находится в поле зрения как в боковом, так и в осевом направлениях. Установите размер шага z, учитывая осевое разрешение микроскопа.ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальный размер z-шага для визуализации мозга личинок рыбок данио-рерио зависит от метода визуализации и разрешения микроскопа. В качестве примера был использован z-шаг размером 5 мкм с учетом толщины легкого листа и среднего диаметра телклеток 10. Продолжите получение изображения для заданного поля зрения.Для объемной структурной визуализации получите 3-D изображение (x, y, z) всего мозга, изменив фокальные плоскости и получив 2-D изображения каждой z-плоскости последовательно. Для функциональной визуализации одной z-плоскости получите изображения временных рядов (x, y, t) нейронной активности мозга на определенной глубине. Для объемной функциональной визуализации получите 4-D изображение (x, y, z, t) активности нейронов во всем мозге путем последовательного получения 3-D изображений.ПРИМЕЧАНИЕ: Установите количество кадров с учетом доступного объема памяти компьютера. Рекомендуется время приобретения менее 1 ч из-за продолжительности действия бромида панкурония. После получения изображений сохраните результаты и запишите параметры изображения (например, размер пикселя, размер z-шага, частоту кадров, мощность лазера) для анализа изображений. Экспортируйте изображения в соответствующий формат для рендеринга данных и анализа изображений.ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется экспортировать изображения в формате файла изображения с тегами (TIF). TIF поддерживает сжатие изображений без потерь и совместим с большинством программ для обработки изображений и языков программирования. Кроме того, формат TIF поддерживает включение метаданных, таких как параметры съемки, разрешение изображения и другую соответствующую информацию, которая может помочь в интерпретации и воспроизводимости данных. 5. Настройка визуализаций с помощью napari ПРИМЕЧАНИЕ: napari — это программа для просмотра многомерных изображений с открытым исходным кодом в среде Python с рендерингом33 на основе графического процессора (GPU). Плагин napari-animation обеспечивает программное создание фильмов. Использование Fiji, программы обработки изображений с открытым исходным кодом, рекомендуется для обработки изображений общего назначения, такой как фильтрация и геометрическое преобразование (см. Таблицу материалов). Исходный код, используемый для визуализации с помощью napari, доступен на GitHub (https://github.com/NICALab/Zebrafish-brain-visualization). Установите napari и napari-animation с помощью pip или conda. После установки создайте новый файл записной книжки jupyter.ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется работать с записной книжкой jupyter, которая является интерактивным инструментом для Python, а не со скриптом Python. Импорт napari и napari-animation. 6. Визуализация структур с помощью напари Чтобы визуализировать изображения и создать видеоролики о мозге рыбок данио, загрузите 3D-изображение (x,y,z) и откройте окно napari. Подключите плагин napari-animation (рисунок 3A). Задайте такие параметры, как размер вокселей, цветовая карта и пределы контрастности в элементах управления слоями. Отрегулируйте параметры просмотра (например, перспективу, углы) на холсте. Чтобы захватить визуализированное изображение, нажмите кнопку захвата в мастере анимации. Чтобы создать видеоролики визуализированного объема, измените настройки средства просмотра и добавьте ключевые кадры (рис. 3B). После добавления ключевых кадров задайте количество кадров (шагов) между ключевыми кадрами в мастере анимации. Сохраните визуализированную анимацию. 7. Обработка изображений и визуализация активности нейронов с помощью напари ПРИМЕЧАНИЕ : Чтобы визуализировать изображения нейронной активности во временных рядах в виде наложенных изображений статического фона и активности, к необработанным изображениям должен быть применен алгоритм декомпозиции. Используйте реализацию алгоритма декомпозиции MATLAB под названием BEAR24. Версия MATLAB BEAR доступна на GitHub (https://github.com/NICALab/BEAR). Чтобы разложить статический фон и активность нейронов, примените BEAR к необработанным изображениям временных рядов (x, y, t или x, y, z, t). После декомпозиции сохраните изображения фона и активности нейронов в виде файлов TIF (рис. 3C). Загрузите фоновые изображения и изображения нейронной активности и откройте окно напари. Подключите плагин napari-animation. Используйте серую цветовую карту для фоновых изображений и горячую цветовую карту для изображений нейронной активности (рис. 3C). Задайте такие параметры, как пределы непрозрачности и контрастности в элементах управления слоями. Чтобы создать видеоролики с активностью нейронов, измените настройки средства просмотра и добавьте ключевые кадры для рендеринга анимации. После добавления ключевых кадров задайте количество кадров (шагов) между ключевыми кадрами в мастере анимации. Сохраните визуализированную анимацию.

Representative Results

Структура и нейрональная активность мозга личинок рыбок данио, экспрессирующих индикатор кальция GCaMP7a (Tg(huc:GAL4); Tg(UAS:GCaMP7a))20,21,22 с фоном Каспера (mitfa(w2/w2);mpv17(a9/a9))34 был изображен на 3-4 d.p.f. в соответствии с описанным протоколом. Для объемной структурной визуализации образец был изображен с использованием коммерческой системы точечной сканирующей конфокальной микроскопии, оснащенной линзой для погружения в воду 16x 0,8 NA. Лазер возбуждения с длиной волны 488 нм использовался как для структурной, так и для функциональной визуализации. Частота кадров, разрешение изображения, размер пикселя и размер осевого шага составляли 0,25 Гц, 2048 x 2048, 0,34 мкм и 1,225 мкм соответственно. Получение изображения заняло примерно 1 час 20 минут. Объемное поле зрения полученного изображения охватывало области переднего, среднего и заднего мозгов (рис. 4А). Тела нейрональных клеток продолговатого мозга, мозжечковой пластинки, тектума зрительного нерва, габенулы и дорсального головного мозга во всем мозге личинок рыбок данио-рерио 4 d.p.f. были хорошо видны на изображениях конфокальной микроскопии (рис. 4B). 3D-рендеринг изображений конфокальной микроскопии был выполнен с использованием napari27 в соответствии с вышеупомянутым протоколом (рис. 4C и видео 1). Для функциональной визуализации в 2-D образец был визуализирован с использованием той же системы конфокальной микроскопии, оснащенной линзой объектива 16x 0,8 NA, погружающейся в воду. Частота кадров, разрешение изображения и размер пикселя составляли 2 Гц, 512 x 256 и 1,5 мкм соответственно. Тела нейрональных клеток были хорошо видны как на заднем плане, так и на наложенной нейронной активности (рис. 5A, B). Для 3-D функциональной визуализации была использована специально разработанная система 3-D микроскопии18 , которая была способна in vivo визуализировать нейронную активность всего мозга личинок рыбок данио-рерио с полем зрения 1040 мкм × 400 мкм × 235 мкм и боковым и осевым разрешениями 1,7 мкм и 5,4 мкм соответственно. Скорость визуализации составила до 4,2 объема в секунду. Подобно рендерингу данных структурной визуализации, напари использовался для 3D-рендеринга данных визуализации кальция всего мозга (рис. 5C и видео 2). Рисунок 1: Обзор экспериментальной процедуры. Подготовка проб и парализация рыбок данио-рерио (шаг 1). Препарат 2% (мас./об.) агарозного геля (стадия 2). Монтаж и позиционирование образца (шаг 3). Получение изображения (шаг 4). Обработка изображений и визуализация структуры и активности нейронов (шаг 5-7). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 2: Экспериментальная процедура подготовки визуализации всего мозга . (A) Скрининговый образец рыбок данио, экспрессирующих паннейрональный GCaMP7a, в чашке Петри, наполненной яичной водой. (B) Оборудование и материалы, необходимые для монтажа и позиционирования образца. (1) Тепловой блок при 37 °C; (2) 2% (мас./об.) агарозный гель; (3) микроцентрифужная пробирка объемом 1,5 мл; (4) яичная вода; 5) 0,25 мг/мл раствора бромида панкурония; (6) чашка Петри; (7) щипцы; (8) Пипетка для переноса. (C) Стереомикроскопическое изображение парализованного образца. Черная стрелка указывает на сердце образца. (D) Образец в микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 мл переносится с помощью пипетки. На врезке показан увеличенный вид коробочной области. (E) Образец (черная стрелка) помещают в центр чашки Петри с помощью щипцов. (F) Образец выравнивается с помощью щипцов. (G) Пример смещенного внедренного образца. (H) Пример выровненного встроенного образца. (I) Образец помещают на столик микроскопа под линзой объектива для получения изображения. Масштабная линейка: 500 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 3: Визуализация изображений мозга личинок рыбок данио . (A) 3-D рендеринг конфокального микроскопического изображения личинок рыбок данио-рерио (4 d.p.f) мозга, экспрессирующих паннейрональный GCaMP7a. Для рендеринга использовался napari, многомерный просмотрщик изображений с открытым исходным кодом в среде Python. Окно napari содержит элементы управления слоями (красное прямоугольнико), список слоев (желтое прямоугольнико), холст (синее прямоугольнико) и мастер анимации (зеленое прямоугольнико). (B) Для рендеринга анимации добавлены ключевые кадры с несколькими настройками просмотра. (C) Конфокальное микроскопическое изображение 2-D покадровой визуализации активности нейронов в мозге личинок рыбок данио. Изображение разлагается на фон (слева) и активность нейронов (посередине), затем накладывается (справа). Масштабная линейка: 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 4: Визуализация структуры мозга личинок рыбок данио. (A) Проекция максимальной интенсивности (MIP) изображения конфокальной микроскопии личинок рыбок данио-рерио (4 d.p.f.) мозга, экспрессирующих паннейрональный GCaMP7a. Сверху: боковой MIP. Днище: осевой MIP. Каждая граница содержит передний мозг (красный), средний мозг (желтый) и задний мозг (синий). (B) В общей сложности 10 осевых срезов на разной глубине из объемного изображения мозга (при z = 25 мкм, 50 мкм, 75 мкм, 100 мкм, 125 мкм, 150 мкм, 175 мкм, 200 мкм, 225 мкм, 250 мкм, считанных сверху вниз; z = 0 мкм указывает на верхнюю поверхность мозга). Каждая белая коробка представляет область мозга (продолговатый мозг, мозжечковая пластинка, тектум зрительного нерва, габенула и дорсальный головной мозг). (C) Весь мозг визуализируется с помощью напари. Масштабная линейка: 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 5: Визуализация нейронной активности мозга личинок рыбок данио . (A) Изображение конфокальной микроскопии активности нейронов в мозге личинок рыбок данио-рерио (4 d.p.f.), экспрессирующих паннейрональный GCaMP7a. Масштабная линейка: 100 мкм. (B) Увеличенный вид коробочной области в А , показывающий активность нейронов в оптическом тектуме в несколько моментов времени. Масштабная линейка: 20 мкм. (C) 3D-визуализация активности нейронов всего мозга в мозге личинок рыбок данио, полученная с помощью специально разработанного микроскопа (слева: t = 133 с; справа: t = 901 с). Активность нейронов накладывается на статический фон. Масштабная линейка: 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 6: Покадровая съемка с дрейфом образца и без него. (A) Покадровая визуализация мозга личинок рыбок данио, экспрессирующих паннейрональный GCaMP7a с дрейфом образца. Яичную воду добавляли в образец перед затвердеванием агарозного геля (этап 3.6-3.7). Рыба двигалась в боковом и осевом направлениях. (B) Покадровая съемка мозга личинок рыбок данио-рерио без дрейфа образца. Яичную воду добавляли в образец после затвердевания агарозного геля (этап 3.6-3.7). Масштабная линейка: 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Видео 1: 3-D рендеринг структуры всего мозга личинки рыбки данио-рерио (4 d.p.f.), мозг экспрессирует паннейрональный GCaMP7a. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео. Видео 2: 3D-рендеринг активности нейронов всего мозга в мозге личинок рыбок данио-рерио (4 d.p.f.), экспрессирующих паннейрональный GCaMP7a. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.

Discussion

Текущий протокол позволяет in vivo визуализировать весь мозг личинок рыбок данио-рерио в течение длительного периода времени (например, более 1 часа) и визуализировать полученные данные структурной и функциональной визуализации.

Наиболее важными этапами являются монтаж и позиционирование образца. Во время заделки образца крайне важно предотвратить образование пузырьков и избежать попадания пыли в агарозный гель. Если гель содержит пузырьки воздуха и пыль, качество изображения может сильно ухудшиться. При позиционировании образца с помощью щипцов важно следить за тем, чтобы образец был ровным как по горизонтали, так и по вертикали. В противном случае интересующие области могут не содержаться в поле зрения микроскопа. Кроме того, это позиционирование должно быть выполнено в течение короткого промежутка времени до затвердевания агарозного геля, чтобы избежать повреждения его поверхности, поскольку такое повреждение ухудшает качество изображения.

Еще одна серьезная проблема заключается в том, чтобы избежать движения на изображениях, которые возникают из-за неполного затвердевания агарозного геля (рис. 6) и паралича рыбок данио. Когда яичная вода добавляется в образец до полного затвердевания геля агорсе, рыба медленно движется как в боковом, так и в осевом направлении, проявляясь в виде дрейфа образца на изображениях временных рядов (рис. 6А). Если доза паралитиков недостаточна или продолжительность эффекта заканчивается, образец может попытаться двигаться, что проявляется в виде быстрого подергивания на покадровых изображениях.

Несмотря на важность вышеупомянутых этапов для получения высококачественных изображений без артефактов движения, общедоступные протоколы 15,16,17,18,19 дают лишь краткий обзор экспериментальной процедуры, в которых отсутствуют эти детали. Например, изображения, полученные без протоколов11 иммобилизации, страдают от существенных артефактов движения, которые затрудняют последующий анализ изображений. Интегрируя основные компоненты, такие как затвердевание агарозного геля и парализация образца, наш протокол значительно повышает согласованность качества получаемых изображений при минимизации артефактов движения.

Таким образом, описана оптимизированная и воспроизводимая экспериментальная процедура визуализации мозга личинок рыбок данио-рерио in vivo. Достоверность и воспроизводимость этого протокола для визуализации активности и структуры мозга in vivo были подтверждены в нескольких условиях 14,18,29,30,31. Настоящий рабочий процесс сосредоточен на визуализации всего мозга личинок рыбок данио, но он может быть легко применен для визуализации других органов личинок рыбок данио-рерио35,36.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Линии рыбок данио, используемые для визуализации кальция, были предоставлены Центром моделирования заболеваний рыбок данио-рерио (ZCDM), Корея. Это исследование было поддержано Национальным исследовательским фондом Кореи (2020R1C1C1009869, NRF2021R1A4A102159411, RS-2023-00209473).

Materials

1.5 mL microcentrifuge tube SciLab SL.Tub3513 To aliquot agarose gel and pancuronium bromide solution
15 mL Falcon tubes Falcon 352096 To prepare agarose gel and pancuronium bromide solution
16× 0.8NA water dipping objective lens Nikon CFI75 LWD 16×W Objective lens for whole-brain imaging
1-phenyl 2-thiourea (PTU) Sigma-Aldrich P7629-10G 200 μM of 1-phenyl 2-thiourea (PTU)
50 mL Falcon tubes Falcon 352070 To prepare egg water
Disposable transfer pipette SciLab SL.Pip3032 To transfer zebrafish larvae
Egg water N/A N/A 0.6 g sea salt in 10 L deionized water
Forceps Karl Hammacher GmbH HSO 010-10 Forceps used for sample positioning
Low melting point agarose Thermo Scientific R0801 2% (wt/vol) agarose gel
Napari Napari N/A To visualize microscopy images in 3-D
NIS-Elements C Nikon N/A Imaging software for confocal microscope
Pancuronium bromide Sigma-Aldrich P1918-10MG 0.25 mg/mL of pancuronium bromide solution
Petri dish, 35 mm SPL Life Sciences 11035 Petri dish used for sample embedding
Petri dish, 55 mm SPL Life Sciences 11050 To prepare zebrafish larvae after screening
Point-scanning confocal microscopy system (C2 Plus) Nikon N/A Confocal microscope for whole-brain imaging
Sea salt  Sigma-Aldrich S9883-500G Sea salt used for preparing egg water
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Choi, T. -. Y., Choi, T. -. I., Lee, Y. -. R., Choe, S. -. K., Kim, C. -. H. Zebrafish as an animal model for biomedical research. Experimental & Molecular Medicine. 53 (3), 310-317 (2021).
  2. Ahrens, M. B., et al. Brain-wide neuronal dynamics during motor adaptation in zebrafish. Nature. 485 (7399), 471-477 (2012).
  3. Panier, T., et al. Fast functional imaging of multiple brain regions in intact zebrafish larvae using selective plane illumination microscopy. Frontiers in Neural Circuits. 7, 65 (2013).
  4. Bianco, I. H., Kampff, A. R., Engert, F. Prey capture behavior evoked by simple visual stimuli in larval zebrafish. Frontiers in Systems Neuroscience. 5, 101 (2011).
  5. Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).
  6. Chen, T. -. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  7. Piatkevich, K. D., et al. A robotic multidimensional directed evolution approach applied to fluorescent voltage reporters. Nature Chemical Biology. 14 (4), 352-360 (2018).
  8. Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
  9. Looger, L., et al. Fast and sensitive GCaMP calcium indicators for imaging neural populations. Biorxiv. , (2021).
  10. Ahrens, M. B., Orger, M. B., Robson, D. N., Li, J. M., Keller, P. J. Whole-brain functional imaging at cellular resolution using light-sheet microscopy. Nature Methods. 10 (5), 413-420 (2013).
  11. Prevedel, R., et al. Simultaneous whole-animal 3D imaging of neuronal activity using light-field microscopy. Nature Methods. 11 (7), 727-730 (2014).
  12. Chhetri, R. K., et al. Whole-animal functional and developmental imaging with isotropic spatial resolution. Nature Methods. 12 (12), 1171-1178 (2015).
  13. Ahrens, M. B., Engert, F. Large-scale imaging in small brains. Current Opinion in Neurobiology. 32, 78-86 (2015).
  14. Yoon, Y. -. G., et al. Sparse decomposition light-field microscopy for high speed imaging of neuronal activity. Optica. 7 (10), 1457-1468 (2020).
  15. Randlett, O., et al. Whole-brain activity mapping onto a zebrafish brain atlas. Nature Methods. 12 (11), 1039-1046 (2015).
  16. Cong, L., et al. Rapid whole brain imaging of neural activity in freely behaving larval zebrafish (Danio rerio). eLife. 6, e28158 (2017).
  17. Bruzzone, M., et al. Whole brain functional recordings at cellular resolution in zebrafish larvae with 3D scanning multiphoton microscopy. Scientific Reports. 11 (1), 11048 (2021).
  18. Cho, E. -. S., Han, S., Lee, K. -. H., Kim, C. -. H., Yoon, Y. -. G. 3DM: deep decomposition and deconvolution microscopy for rapid neural activity imaging. Optics Express. 29 (20), 32700-32711 (2021).
  19. Zhang, Z., et al. Imaging volumetric dynamics at high speed in mouse and zebrafish brain with confocal light field microscopy. NatureBiotechnology. 39 (1), 74-83 (2021).
  20. Muto, A., Ohkura, M., Abe, G., Nakai, J., Kawakami, K. Real-time visualization of neuronal activity during perception. Current Biology. 23 (4), 307-311 (2013).
  21. Köster, R. W., Fraser, S. E. Tracing transgene expression in living zebrafish embryos. Developmental Biology. 233 (2), 329-346 (2001).
  22. Park, H. C., et al. Analysis of upstream elements in the HuC promoter leads to the establishment of transgenic zebrafish with fluorescent neurons. Developmental Biology. 227 (2), 279-293 (2000).
  23. Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. Journal of Visualized Experiments. (69), e4196 (2012).
  24. Westerfield, M. . The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). 4th edition. , (2000).
  25. Morsch, M., et al. Triggering cell stress and death using conventional UV laser confocal microscopy. Journal of Visualized Experiments. (120), e54983 (2017).
  26. Antinucci, P., Hindges, R. A crystal-clear zebrafish for in vivo imaging. Scientific Reports. 6, 29490 (2016).
  27. Parker, M. O., Brock, A. J., Millington, M. E., Brennan, C. H. Behavioral phenotyping of casper mutant and 1-pheny-2-thiourea treated adult zebrafish. Zebrafish. 10 (4), 466-471 (2013).
  28. Elsalini, O. A., Rohr, K. B. Phenylthiourea disrupts thyroid function in developing zebrafish. Development Genes and Evolution. 212 (12), 593-598 (2003).
  29. Han, S., Cho, E. -. S., Park, I., Shin, K., Yoon, Y. -. G. Efficient neural network approximation of robust PCA for automated analysis of calcium imaging data. Medical Image Computing and Computer Assisted Intervention. , 595-604 (2021).
  30. Shin, C., et al. Three-dimensional fluorescence microscopy through virtual refocusing using a recursive light propagation network. Medical Image Analysis. 82, 102600 (2022).
  31. Eom, M., et al. Statistically unbiased prediction enables accurate denoising of voltage imaging data. bioRxiv. , (2022).
  32. Johnston, L., et al. Electrophysiological recording in the brain of intact adult zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (81), e51065 (2013).
  33. Sofroniew, N., et al. napari: a multi-dimensional image viewer for Python. Zenodo. , 3555620 (2022).
  34. White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
  35. Mickoleit, M., et al. High-resolution reconstruction of the beating zebrafish heart. Nature Methods. 11 (9), 919-922 (2014).
  36. Voleti, V., et al. Real-time volumetric microscopy of in vivo dynamics and large-scale samples with SCAPE 2.0. Nature Methods. 16 (10), 1054-1062 (2019).

Tags

ZebrafishIn VivoWhole-brain ImagingFluorescence MicroscopyNeuronal ActivitySample PreparationAgarose EmbeddingMotion ArtifactsComputational AnalysisNeural ComputationBrain Mapping

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Cho, E., Han, S., Kim, G., Eom, M., Lee, K., Kim, C., Yoon, Y. In Vivo Whole-Brain Imaging of Zebrafish Larvae Using Three-Dimensional Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (194), e65218, doi:10.3791/65218 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image