这里介绍的是使用三维荧光显微镜对斑马鱼幼虫进行 体内 全脑成像的方案。实验程序包括样品制备、图像采集和可视化。
作为一种脊椎动物模型动物,斑马鱼幼虫广泛用于神经科学,并为以细胞分辨率监测全脑活动提供了独特的机会。在这里,我们提供了一种优化的方案,用于使用三维荧光显微镜对斑马鱼幼虫进行全脑成像,包括样品制备和固定、样品包埋、图像采集和成像后的可视化。目前的协议能够使用共聚焦显微镜和定制设计的荧光显微镜以细胞分辨率对幼虫斑马鱼大脑的结构和神经元活动进行 体内 成像超过1小时。还讨论了方案中的关键步骤,包括样品安装和定位,防止琼脂糖凝胶中的气泡形成和灰尘,以及避免由于琼脂糖凝胶不完全凝固和鱼麻痹而导致的图像运动。该协议已在多种设置中得到验证和确认。该协议可以很容易地适用于斑马鱼幼虫的其他器官成像。
斑马鱼(Danio rerio)因其在幼虫阶段的光学透明度,快速发育,维护成本低以及多种遗传工具的可用性而被广泛采用为神经科学中的模型脊椎动物1,2,3,4。特别是,幼虫的光学透明度与生物事件的基因编码荧光报告基因5,6,7,8,9相结合,为在全脑水平上对神经元活动和结构进行成像提供了独特的机会10,11,12,13,14.然而,即使使用支持细胞分辨率的显微镜,采集的图像也不一定保留单细胞水平的信息;由于用于样品安装的琼脂糖凝胶引入的像差,光学图像质量可能会降低,鱼可能以一定角度安装,因此感兴趣的区域不能完全包含在显微镜的视野内,并且鱼可能会在记录过程中移动,导致图像中的运动伪影或阻碍从图像中提取准确的信号。
因此,需要一种有效且可重现的协议来获取具有最小噪声和运动的高质量图像数据。不幸的是,用于对斑马鱼幼虫全脑成像的公开协议 15,16,17,18,19 仅简要描述了该过程,留下了大部分细节,例如琼脂糖凝固、精确安装技术和使用镊子定位样品,直到每个实验者。此外,琼脂糖浓度和固定方法10,11,14,15,16,17,18,19的不一致可能导致成像过程中鱼类移动带来的挑战。
在这里,提供了使用三维荧光显微镜对斑马鱼幼虫进行全脑成像的详细方案。 图1 提供了该实验方案的图形概述:样品制备和固定、样品包埋、图像采集和成像后的可视化。使用商业共聚焦显微镜和定制设计的荧光显微镜演示幼 虫斑马 鱼大脑体内的结构和功能成像。该协议可以由从业者根据实验需求和设计定制,用于具有某些感官刺激或行为背景的脑成像。
目前的协议能够在较长时间(例如,超过1小时)内对斑马鱼幼虫进行 体内 全脑成像,并对获得的结构和功能成像数据进行可视化。
最关键的步骤是样品安装和定位。在样品包埋过程中,防止气泡形成并避免琼脂糖凝胶中的灰尘至关重要。如果凝胶含有气泡和灰尘,图像质量可能会严重下降。使用镊子定位样品时,重要的是要确保样品水平和垂直水平。否则,感兴趣的区域可能不包含在显微镜的视野内。此外,这种定位应在琼脂糖凝胶凝固前的短时间内完成,以避免对其表面造成损坏,因为这种损坏会影响图像质量。
另一个主要挑战是避免图像中的运动,这些运动来自琼脂糖凝胶的不完全固化(图6)和斑马鱼的麻痹。当在阿戈尔斯凝胶完全凝固之前将蛋水添加到样品中时,鱼在横向和轴向上缓慢移动,在时间序列图像中表现为样品漂移(图6A)。如果麻痹剂的剂量不足或效果持续时间结束,样品可能会尝试移动,这在延时图像中表现为快速抽搐。
尽管上述步骤对于获取没有运动伪影的高质量图像很重要,但公开可用的协议15,16,17,18,19仅提供了实验程序的简要概述,缺乏这些细节。例如,没有固定协议11的采集图像存在大量的运动伪影,这使得下游图像分析具有挑战性。通过集成琼脂糖凝胶固化和样品麻痹等基本组件,我们的实验方案显著提高了采集图像质量的一致性,同时最大限度地减少了运动伪影。
总之,描述了一种优化且可重复的斑马鱼幼虫脑体内成像实验程序。该协议用于大脑活动和结构的体内成像的有效性和可重复性已在多种设置中得到证实14,18,29,30,31。目前的工作流程侧重于斑马鱼幼虫的全脑成像,但它可以很容易地应用于斑马鱼幼虫的其他器官成像35,36。
The authors have nothing to disclose.
用于钙成像的斑马鱼系由韩国斑马鱼疾病建模中心(ZCDM)提供。这项研究得到了韩国国家研究基金会(2020R1C1C1009869,NRF2021R1A4A102159411,RS-2023-00209473)的支持。
1.5 mL microcentrifuge tube | SciLab | SL.Tub3513 | To aliquot agarose gel and pancuronium bromide solution |
15 mL Falcon tubes | Falcon | 352096 | To prepare agarose gel and pancuronium bromide solution |
16× 0.8NA water dipping objective lens | Nikon | CFI75 LWD 16×W | Objective lens for whole-brain imaging |
1-phenyl 2-thiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629-10G | 200 μM of 1-phenyl 2-thiourea (PTU) |
50 mL Falcon tubes | Falcon | 352070 | To prepare egg water |
Disposable transfer pipette | SciLab | SL.Pip3032 | To transfer zebrafish larvae |
Egg water | N/A | N/A | 0.6 g sea salt in 10 L deionized water |
Forceps | Karl Hammacher GmbH | HSO 010-10 | Forceps used for sample positioning |
Low melting point agarose | Thermo Scientific | R0801 | 2% (wt/vol) agarose gel |
Napari | Napari | N/A | To visualize microscopy images in 3-D |
NIS-Elements C | Nikon | N/A | Imaging software for confocal microscope |
Pancuronium bromide | Sigma-Aldrich | P1918-10MG | 0.25 mg/mL of pancuronium bromide solution |
Petri dish, 35 mm | SPL Life Sciences | 11035 | Petri dish used for sample embedding |
Petri dish, 55 mm | SPL Life Sciences | 11050 | To prepare zebrafish larvae after screening |
Point-scanning confocal microscopy system (C2 Plus) | Nikon | N/A | Confocal microscope for whole-brain imaging |
Sea salt | Sigma-Aldrich | S9883-500G | Sea salt used for preparing egg water |