Fare Yenidoğan Beyinlerinin Mikro-BT Görüntüleme ve Morfometrik Analizi
Summary
Bu çalışma, mikro-bilgisayarlı tomografi (mikro-BT) ve ex vivo örneklerde bir kontrast maddeyi birleştirerek yenidoğan fare beyinlerinin yüksek çözünürlüklü görüntülerini elde etme adımlarını açıklamaktadır. Bu görüntülerde beyin boyutunu ve şeklini ölçmek için temel morfometrik analizleri açıklıyoruz.
Abstract
Nörogörüntüler, hayvan modelleri kullanılarak yapılan deneylerde beyin morfolojisini incelemek için değerli bir araçtır. Manyetik rezonans görüntüleme (MRG), yumuşak dokular için standart yöntem haline gelmiştir, ancak düşük uzamsal çözünürlüğü küçük hayvanlar için bazı sınırlar oluşturmaktadır. Burada, mikro-bilgisayarlı tomografi (mikro-BT) kullanarak fare yenidoğan beyinleri ve kafatasları hakkında yüksek çözünürlüklü üç boyutlu (3D) bilgi elde etmek için bir protokol açıklıyoruz. Protokol, numuneleri incelemek, beyni boyamak ve taramak ve tüm organ ve ilgilenilen bölgelerin (ROI’ler) morfometrik ölçümlerini elde etmek için gereken adımları içerir. Görüntü analizi, yapıların segmentasyonunu ve nokta koordinatlarının sayısallaştırılmasını içerir. Özetle, bu çalışma, mikro-BT ve Lugol solüsyonunun kontrast madde olarak kombinasyonunun, küçük hayvanların perinatal beyinlerini görüntülemek için uygun bir alternatif olduğunu göstermektedir. Bu görüntüleme iş akışı, gelişim biyolojisi, biyotıp ve çeşitli genetik ve çevresel faktörlerin beyin gelişimi üzerindeki etkisini değerlendirmekle ilgilenen diğer bilimlerde uygulamalara sahiptir.
Introduction
Mikro bilgisayarlı tomografi (mikro-BT) görüntüleme, farklı araştırma alanları için değerli bir araçtır. Biyolojide, mineralize dokularda X-ışını emilimi nedeniyle özellikle kemik araştırmaları için uygundur. Bu özellik nedeniyle, diğer konuların yanı sıra kemik gelişimi1, metabolizma2 ve evrim 3,4 ile ilgili çeşitli sorulara mikro-BT yardımıyla yaklaşılmıştır. 2008 yılında, de Crespigny ve ark.5, yetişkin fare ve tavşan beyinlerinin mikro-BT görüntülerinin kontrast madde olarak iyot kullanılarak elde edilebileceğini gösterdi. Bu çalışma, bu görüntüleme tekniği için yeni bir uygulama açtı, çünkü iyot, aksi takdirde X-ışınlarına duyarsız olacak yumuşak dokulardan görüntülerin alınmasına izin verdi. Bu nedenle, mikro-BT ve iyot bazlı bir kontrast maddeyi birleştirmenin genel amacı, yumuşak dokuların mezo veya makro anatomik düzeyde ayırt edilebildiği ve tanımlanabildiği yüksek çözünürlüklü görüntüler elde etmektir.
Bu teknik, deneysel tasarımlarda yaygın olarak kullanılan fare embriyoları gibi küçük örneklerin ayrıntılı ex vivo fenotipik karakterizasyonunu gerektiren çalışmalar için dikkate değer bir potansiyele sahiptir6. Mikro-BT görüntüleme ile birlikte iyot kontrastı, organların7 ve dönüm noktası niteliğindeki üç boyutlu (3D) yapıların 8,9 hacimsel niceliklerini elde etmek için kullanılmıştır. Son yıllarda, kemirgenlerin10 beyin fenotipik özelliklerini tanımlamak için boyanmış örneklerin mikro-BT taraması uygulanmış ve teknikte farklı iyileştirmeler önerilmiştir. Yetişkin beyinleri için, bir hidrojel ile önceki bir perfüzyon adımı ile iyot içine 48 saatlik bir daldırma protokolünün, yüksek kaliteli görüntüler ürettiği bulundu11. Gignac ve ark.12, iyotla boyanmış sıçan beyinlerinin rutin histolojik teknikleri uygulamak için işlenebileceğini göstererek bu tekniğin sınırlarını genişletti. Benzer şekilde, bu prosedürler embriyonik ve sütten kesilmeden önce kemirgen beyinleri için umut verici sonuçlar göstermektedir 8,13,14,15.
Sinirbilim, beyin gelişiminin farklı yapısal ve işlevsel yönlerini değerlendirmek için büyük ölçüde mikroskop tabanlı teknikler uygulamış olsa da, bu tür çalışmalar belirli hücre popülasyonlarını veya mekansal olarak sınırlı yapıları karakterize etmek için daha uygundur. Tersine, mikro-BT görüntüleme, tüm yapıların tanımlanmasına ve mikroskobik tekniklerin tamamlayıcısı olan ilgili uzamsal bilgileri koruyan 3D modellerin elde edilmesine izin verir. Manyetik rezonans görüntüleme (MRG) de küçük hayvanların yapısal özelliklerini araştırmak için uygulanan standart bir tekniktir 16,17,18. Bununla birlikte, bir kontrast madde kullanan mikro-BT’nin ex vivo sabit numuneler için iki ana avantajı vardır: mikro-BT tarayıcıları büyük ölçüde daha ucuzdur ve kullanımı kolaydır ve MRI12’den daha yüksek bir uzamsal çözünürlüğe izin verir.
Bu çalışma, iyot bazlı bir kontrast madde olan Lugol çözeltisi ile boyandıktan sonra mikro-BT taraması kullanılarak yenidoğan fare beyinlerinden yüksek çözünürlüklü görüntüler elde etme prosedürünü tanımlamayı amaçlamaktadır. Numune toplama ve dokuların fiksasyonu gibi ön aşamalarla başlayan ve boyama, mikro-BT görüntü elde etme ve standart işlemeden geçen kapsamlı bir protokol sunulmaktadır. Görüntü işleme, tüm kafanın ve beynin 3 boyutlu hacminin segmentasyonunu ve daha sonra morfometrik analizlerde kullanılabilecek nokta koordinatlarını sayısallaştırmak için belirli anatomik düzlemlerin seçilmesini içerir. Burada odak noktası yenidoğan fare beyni olsa da, benzer stratejiler diğer yumuşak dokulara da uygulanabilir. Bu nedenle, burada sunulan protokol, ince değişikliklerle diğer numune türlerine uygulanabilecek kadar esnektir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu çalışmada, mikro-BT kullanarak farelerin yenidoğan beyin dokularını kontrast madde ile taramak için özlü bir protokol tanıtılmıştır. Ek olarak, nicel ve nitel çıktılar elde etmek için basit prosedürler içerir. Bu yöntemlere dayanarak, daha fazla alternatif veya tamamlayıcı analiz yapılabilir.
Protokolde gösterildiği gibi, mikro-BT görüntüleri farklı şekillerde analiz edilebilir. Önceki çalışmalarda grubumuz, noktaların koordinatlarını sayısallaştırar…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wei Liu’ya teknik yardımı için teşekkür ederiz. Bu çalışma ANPCyT PICT 2017-2497 ve PICT 2018-4113 tarafından finanse edilmektedir.
Materials
| µCT 35 | Scanco Medical AG | Note that Scanco does not offer the µCT 35 anymore. Their smallest scanner is now the µCT 45 | |
| Avizo | Visualization Sciences Group, VSG | ||
| C57BL/6 Mice | Bioterio Facultad de Ciencias Veterinarias Universidad Nacional de La Plata | ||
| Conical tubes | Daigger | CH-CI4610-1856 | |
| Flux cabinet | Esco | AC2-458 | |
| Glass beaker | Glassco | GL-229.202.10 | |
| Glass bottle | Simax | CFB017 | |
| Glass funnel | HDA | VI1108 | |
| HCl | Carlo Erba | 403872 | Manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves) |
| I2 | Cicarelli | 804211 | When preparing I2KI, manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves) |
| KI | Cicarelli | PA131542.1210 | When preparing I2KI, manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves) |
| Magnetic stirring | Arcano | 4925 | |
| NaOH | Cicarelli | 1580110 | Manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves) |
| Orbital shaker | Biomint | BM021 | |
| Paraformaldehyde | Biopack | 2000959400 | Manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves) |
| Paton spatula | Glassco | GL-377.303.01 | |
| PBS | Biopack | 2000988800 | |
| Plastic Pasteur pipette | Daigger | 9153 | |
| R | R Project | The package geomorph for R was used in the protocol (https://cran.r-project.org/web/packages/geomorph/index.html) | |
| Scissors | Belmed | ||
| Sodium azide | Biopack | 2000163500 | |
| Thermometer | Daigger | 7650 |
References
- Altman, A. R., et al. Quantification of skeletal growth, modeling, and remodeling by in vivo micro-computed tomography. Bone. 81, 370-379 (2015).
- Wehrle, E., et al. Spatio-temporal characterization of fracture healing patterns and assessment of biomaterials by time-lapsed in vivo micro-computed tomography. Scientific Reports. 11 (1), 8660 (2021).
- Arístide, L., et al. Brain shape convergence in the adaptive radiation of New World monkeys. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (8), 2158-2163 (2016).
- Paluh, D. J., Stanley, E. L., Blackburn, D. C. Evolution of hyperossification expands skull diversity in frogs. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (15), 8554-8562 (2020).
- de Crespigny, A., et al. 3D micro-CT imaging of the postmortem brain. Journal of Neuroscience Methods. 171 (2), 207-213 (2008).
- Gignac, P. M., et al. Diffusible iodine-based contrast-enhanced computed tomography (diceCT): an emerging tool for rapid, high-resolution, 3-D imaging of metazoan soft tissues. Journal of Anatomy. 228 (6), 889-909 (2016).
- Wong, M. D., Dorr, A. E., Walls, J. R., Lerch, J. P., Henkelman, R. M. A novel 3D mouse embryo atlas based on micro-CT. Development. 139 (17), 3248-3256 (2012).
- Gonzalez, P. N., et al. Chronic protein restriction in mice impacts placental function and maternal body weight before fetal growth. PLoS One. 11 (3), 0152227 (2016).
- Watanabe, A., et al. Are endocasts good proxies for brain size and shape in archosaurs throughout ontogeny. Journal of Anatomy. 234 (3), 291-305 (2019).
- Gignac, P. M., Kley, N. J. The utility of diceCT imaging for high-throughput comparative neuroanatomical studies. Brain, Behavior and Evolution. 91 (3), 180-190 (2018).
- Anderson, R., Maga, A. M. A novel procedure for rapid imaging of adult mouse brains with microCT using iodine-based contrast. PLoS One. 10 (11), e0142974 (2015).
- Gignac, P. M., O’Brien, H. D., Sanchez, J., Vazquez-Sanroman, D. Multiscale imaging of the rat brain using an integrated diceCT and histology workflow. Brain Structure & Function. 226 (7), 2153-2168 (2021).
- Wong, M. D., Spring, S., Henkelman, R. M. Structural stabilization of tissue for embryo phenotyping using micro-CT with iodine staining. PLoS One. 8 (12), e84321 (2013).
- Barbeito-Andrés, J., et al. Congenital Zika syndrome is associated with maternal protein malnutrition. Science Advances. 6 (2), (2020).
- Handschuh, S., Glösmann, M. Mouse embryo phenotyping using X-ray microCT. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 949184 (2022).
- Turnbull, D. H., Mori, S. MRI in mouse developmental biology. NMR in Biomedicine. 20 (3), 265-274 (2007).
- Qiu, L. R., et al. Mouse MRI shows brain areas relatively larger in males emerge before those larger in females. Nature Communications. 9, 2615 (2018).
- Lerch, J. P., Sled, J. G., Henkelman, R. M. MRI phenotyping of genetically altered mice. Methods in Molecular Biology. 711, 349-361 (2011).
- Gonzalez, P. N., Kristensen, E., Morck, D. W., Boyd, S., Hallgrímsson, B. Effects of growth hormone on the ontogenetic allometry of craniofacial bones. Evolution & Development. 15 (2), 133-145 (2016).
- Metscher, B. D. MicroCT for developmental biology: a versatile tool for high-contrast 3D imaging at histological resolutions. Developmental Dynamics. 238 (3), 632-640 (2009).
- Vickerton, P., Jarvis, J., Jeffery, N. Concentration-dependent specimen shrinkage in iodine-enhanced microCT. Journal of Anatomy. 223 (2), 185-193 (2013).
- Dawood, Y., et al. Reducing soft-tissue shrinkage artefacts caused by staining with Lugol’s solution. Scientific Reports. 11, 19781 (2021).
