Micro-TC e Análise Morfométrica de Cérebros Neonatais de Camundongos

A microtomografia computadorizada (micro-TC) é uma ferramenta valiosa para diferentes campos de pesquisa. Em biologia, é especialmente adequado para pesquisa óssea por causa da absorção de raios-X em tecidos mineralizados. Devido a essa característica, diversas questões relacionadas^{ao desenvolvimento} ósseo1, metabolismo^{2, evolução3,4}, entre outros tópicos, têm sido abordadas com o auxílio da micro-TC. Em 2008, de Crespigny et ^al.5 mostraram que imagens de micro-TC de cérebros adultos de camundongos e coelhos poderiam ser obtidas usando iodo como agente de contraste. Este trabalho abriu uma nova aplicação para esta técnica de imagem, uma vez que o iodo permitiu a aquisição de imagens de tecidos moles que, de outra forma, seriam insensíveis aos raios X. Assim, o objetivo geral da combinação de micro-TC e contraste iodado é obter imagens de alta resolução, nas quais os tecidos moles possam ser distinguidos e identificados em nível meso ou macroanatômico.

Esta técnica tem notável potencial para estudos que requerem caracterização fenotípica ex vivo detalhada de pequenos espécimes, como embriões de camundongos, que são amplamente utilizados em planejamentos^{experimentais6}. O contraste iodado em combinação com imagens de micro-TC tem sido usado para obter quantificações volumétricas de órgãos⁷ e estruturas tridimensionais (3D) de pontos^{de referência 8,9}. Nos últimos anos, a microtomografia computadorizada de amostras coradas tem sido aplicada para descrever características fenotípicas cerebrais de^roedores10, e diferentes aprimoramentos na técnica têm sido propostos. Para cérebros adultos, um protocolo de 48 h de imersão em iodo, com etapa prévia de perfusão com hidrogel, produziu imagens de alta^qualidade11. Gignac et ^al.12 expandiram os limites dessa técnica ao mostrar que cérebros de ratos corados com iodo poderiam ser processados para realizar técnicas histológicas de rotina. Da mesma forma, esses procedimentos demonstram resultados promissores para cérebros embrionários e pré-desmamados^de roedores 8,13,14,15.

Embora a neurociência tenha aplicado amplamente técnicas baseadas em microscópios para avaliar diferentes aspectos estruturais e funcionais do desenvolvimento cerebral, tais estudos são mais adequados para caracterizar populações celulares específicas ou estruturas espacialmente limitadas. Por outro lado, a micro-TC permite a descrição de estruturas inteiras e a aquisição de modelos 3D que preservam informações espaciais relevantes, o que é complementar às técnicas microscópicas. A ressonância magnética (RM) também é uma técnica padrão aplicada para explorar as características estruturais de pequenos animais16,17,18. Entretanto, a micro-TC, com o uso de contraste, apresenta duas vantagens principais para as amostras fixas ex vivo: os microtomógrafos são em grande parte menos dispendiosos e de fácil operação, além de permitirem maior resolução espacial que a^RM12.

O objetivo deste trabalho é descrever o procedimento de obtenção de imagens de alta resolução de encéfalos de camundongos neonatais, utilizando microtomografia computadorizada após coloração com solução de Lugol, um meio de contraste iodado. Um protocolo abrangente é apresentado, que começa com etapas preliminares, como coleta de amostras e fixação dos tecidos, e passa pela coloração, aquisição de imagens de micro-TC e processamento padrão. O processamento de imagens inclui a segmentação de um volume 3D da cabeça completa, bem como do cérebro, e a seleção de planos anatômicos específicos para digitalizar coordenadas pontuais que poderiam ser usadas em análises morfométricas. Embora o foco aqui seja o cérebro de camundongos neonatais, estratégias semelhantes podem ser aplicadas a outros tecidos moles. Assim, o protocolo aqui apresentado é flexível o suficiente para ser aplicado, com modificações sutis, a outros tipos de amostras.