הדמיית מיקרו-CT וניתוח מורפומטרי של מוחות יילודים בעכברים
Summary
מחקר זה מתאר את השלבים להשגת תמונות ברזולוציה גבוהה של מוחות עכבר בילודים על ידי שילוב טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת (micro-CT) וסוכן ניגוד בדגימות ex vivo . אנו מתארים ניתוחים מורפומטריים בסיסיים כדי לכמת את גודל המוח וצורתו בתמונות אלה.
Abstract
תמונות מוחיות הן כלי רב ערך לחקר מורפולוגיה של המוח בניסויים באמצעות מודלים של בעלי חיים. דימות תהודה מגנטית (MRI) הפך לשיטה הסטנדרטית עבור רקמות רכות, אם כי הרזולוציה המרחבית הנמוכה שלה מציבה מגבלות מסוימות עבור בעלי חיים קטנים. במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול לקבלת מידע תלת-ממדי (תלת-ממדי) ברזולוציה גבוהה על מוחות וגולגולות של עכברים באמצעות טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת (micro-CT). הפרוטוקול כולל את השלבים הדרושים כדי לנתח את הדגימות, להכתים ולסרוק את המוח, ולקבל מדידות מורפומטריות של כל האיבר ואזורי העניין (ROIs). ניתוח תמונה כולל פילוח מבנים ודיגיטציה של קואורדינטות נקודתיות. לסיכום, עבודה זו מראה כי השילוב של מיקרו-CT והפתרון של לוגול כחומר ניגוד הוא חלופה מתאימה להדמיית מוחות פרינטליים של בעלי חיים קטנים. לתהליך הדמיה זה יש יישומים בביולוגיה התפתחותית, ביו-רפואה ומדעים אחרים המעוניינים להעריך את ההשפעה של גורמים גנטיים וסביבתיים מגוונים על התפתחות המוח.
Introduction
הדמיית טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת (micro-CT) היא כלי רב ערך לתחומי מחקר שונים. בביולוגיה, הוא מתאים במיוחד לחקר העצם בגלל ספיגת קרני רנטגן ברקמות מינרליות. בשל תכונה זו, שאלות מגוונות לגבי התפתחות עצם1, מטבוליזם2, ואבולוציה 3,4, בין נושאים אחרים, ניגשו בעזרת micro-CT. בשנת 2008, de Crespigny et al.5 הראו כי ניתן להשיג תמונות מיקרו-CT של מוחות עכברים וארנבים בוגרים באמצעות יוד כחומר ניגוד. עבודה זו פתחה יישום חדש לטכניקת הדמיה זו, שכן יוד איפשר רכישת תמונות מרקמות רכות שאחרת לא היו רגישות לקרני רנטגן. לפיכך, המטרה הכללית של שילוב micro-CT וחומר ניגוד מבוסס יוד היא להשיג תמונות ברזולוציה גבוהה, שבו רקמות רכות ניתן להבחין ולזהות ברמה אנטומית meso או מאקרו.
לטכניקה זו פוטנציאל בולט למחקרים הדורשים אפיון פנוטיפי מפורט של דגימות קטנות, כגון עוברי עכברים, הנמצאים בשימוש נרחב בעיצובים ניסיוניים6. ניגודיות יוד בשילוב עם הדמיית מיקרו-CT שימשה להשגת כימות נפחי של איברים7 ומבנים תלת-ממדיים (תלת-ממדיים) 8,9. בשנים האחרונות בוצעה סריקת מיקרו-CT של דגימות מוכתמות לתיאור תכונות פנוטיפיות מוחיות של מכרסמים10, והוצעו שיפורים שונים בטכניקה. עבור מוחות בוגרים, פרוטוקול של 48 שעות של טבילה ביוד, עם שלב קודם של זילוח עם הידרוג’ל, נמצא לייצר תמונות באיכות גבוהה11. Gignac et al.12 הרחיבו את גבולות הטכניקה הזו בכך שהראו שמוחות של חולדות המוכתמים ביוד יכולים להיות מעובדים כדי לבצע טכניקות היסטולוגיות שגרתיות. באופן דומה, הליכים אלה מראים תוצאות מבטיחות עבור מוחות עובריים וטרום גמילה של מכרסמים 8,13,14,15.
אף על פי שמדעי המוח יישמו במידה רבה טכניקות מבוססות מיקרוסקופ כדי להעריך היבטים מבניים ותפקודיים שונים של התפתחות המוח, מחקרים כאלה מתאימים יותר לאפיון אוכלוסיות תאים ספציפיות או מבנים מוגבלים מרחבית. לעומת זאת, הדמיית מיקרו-CT מאפשרת תיאור מבנים שלמים ורכישת מודלים תלת-ממדיים המשמרים מידע מרחבי רלוונטי, המשלים טכניקות מיקרוסקופיות. דימות תהודה מגנטית (MRI) הוא גם טכניקה סטנדרטית המיושמת כדי לחקור את התכונות המבניות של בעלי חיים קטנים 16,17,18. עם זאת, למיקרו-CT, עם שימוש בחומר ניגוד, יש שני יתרונות עיקריים עבור דגימות קבועות ex vivo: סורקי מיקרו-CT הם לרוב זולים יותר וקלים לתפעול, ומאפשרים רזולוציה מרחבית גבוהה יותר מאשר MRI12.
עבודה זו נועדה לתאר את ההליך לקבלת תמונות ברזולוציה גבוהה ממוחות עכברים בילודים באמצעות סריקת מיקרו-CT לאחר צביעה בתמיסה של לוגול, חומר ניגוד מבוסס יוד. מוצג פרוטוקול מקיף, שמתחיל בשלבים ראשוניים כמו איסוף דגימות וקיבוע רקמות, עובר דרך צביעה, רכישת תמונת מיקרו-CT ועיבוד סטנדרטי. עיבוד תמונה כולל פילוח של נפח תלת-ממדי של הראש השלם, כמו גם של המוח, ובחירה של מישורים אנטומיים ספציפיים לדיגיטציה של קואורדינטות נקודתיות שניתן להשתמש בהן בניתוחים מורפומטריים. למרות שהמוקד כאן הוא מוח העכבר בילוד, אסטרטגיות דומות יכולות להיות מיושמות על רקמות רכות אחרות. לפיכך, הפרוטוקול המוצג כאן גמיש מספיק כדי להיות מיושם, עם שינויים עדינים, על סוגים אחרים של דגימות.
Protocol
Representative Results
Discussion
בעבודה זו מוצג פרוטוקול תמציתי לסריקת רקמות מוח יילודים של עכברים באמצעות מיקרו-CT עם חומר ניגוד. בנוסף, הוא כולל נהלים פשוטים להשגת תפוקות כמותיות ואיכותיות. בהתבסס על שיטות אלה, ניתן לבצע ניתוחים חלופיים או משלימים נוספים.
כפי שמוצג בפרוטוקול, ניתן לנתח תמונות מיקרו-CT בדרכ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לוויי ליו על עזרתו הטכנית. עבודה זו ממומנת על ידי ANPCyT PICT 2017-2497 ו- PICT 2018-4113.
Materials
| µCT 35 | Scanco Medical AG | Note that Scanco does not offer the µCT 35 anymore. Their smallest scanner is now the µCT 45 | |
| Avizo | Visualization Sciences Group, VSG | ||
| C57BL/6 Mice | Bioterio Facultad de Ciencias Veterinarias Universidad Nacional de La Plata | ||
| Conical tubes | Daigger | CH-CI4610-1856 | |
| Flux cabinet | Esco | AC2-458 | |
| Glass beaker | Glassco | GL-229.202.10 | |
| Glass bottle | Simax | CFB017 | |
| Glass funnel | HDA | VI1108 | |
| HCl | Carlo Erba | 403872 | Manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves) |
| I2 | Cicarelli | 804211 | When preparing I2KI, manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves) |
| KI | Cicarelli | PA131542.1210 | When preparing I2KI, manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves) |
| Magnetic stirring | Arcano | 4925 | |
| NaOH | Cicarelli | 1580110 | Manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves) |
| Orbital shaker | Biomint | BM021 | |
| Paraformaldehyde | Biopack | 2000959400 | Manipulate under a flux cabinet and use personal protective equipment (mask, glass and gloves) |
| Paton spatula | Glassco | GL-377.303.01 | |
| PBS | Biopack | 2000988800 | |
| Plastic Pasteur pipette | Daigger | 9153 | |
| R | R Project | The package geomorph for R was used in the protocol (https://cran.r-project.org/web/packages/geomorph/index.html) | |
| Scissors | Belmed | ||
| Sodium azide | Biopack | 2000163500 | |
| Thermometer | Daigger | 7650 |
References
- Altman, A. R., et al. Quantification of skeletal growth, modeling, and remodeling by in vivo micro-computed tomography. Bone. 81, 370-379 (2015).
- Wehrle, E., et al. Spatio-temporal characterization of fracture healing patterns and assessment of biomaterials by time-lapsed in vivo micro-computed tomography. Scientific Reports. 11 (1), 8660 (2021).
- Arístide, L., et al. Brain shape convergence in the adaptive radiation of New World monkeys. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (8), 2158-2163 (2016).
- Paluh, D. J., Stanley, E. L., Blackburn, D. C. Evolution of hyperossification expands skull diversity in frogs. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (15), 8554-8562 (2020).
- de Crespigny, A., et al. 3D micro-CT imaging of the postmortem brain. Journal of Neuroscience Methods. 171 (2), 207-213 (2008).
- Gignac, P. M., et al. Diffusible iodine-based contrast-enhanced computed tomography (diceCT): an emerging tool for rapid, high-resolution, 3-D imaging of metazoan soft tissues. Journal of Anatomy. 228 (6), 889-909 (2016).
- Wong, M. D., Dorr, A. E., Walls, J. R., Lerch, J. P., Henkelman, R. M. A novel 3D mouse embryo atlas based on micro-CT. Development. 139 (17), 3248-3256 (2012).
- Gonzalez, P. N., et al. Chronic protein restriction in mice impacts placental function and maternal body weight before fetal growth. PLoS One. 11 (3), 0152227 (2016).
- Watanabe, A., et al. Are endocasts good proxies for brain size and shape in archosaurs throughout ontogeny. Journal of Anatomy. 234 (3), 291-305 (2019).
- Gignac, P. M., Kley, N. J. The utility of diceCT imaging for high-throughput comparative neuroanatomical studies. Brain, Behavior and Evolution. 91 (3), 180-190 (2018).
- Anderson, R., Maga, A. M. A novel procedure for rapid imaging of adult mouse brains with microCT using iodine-based contrast. PLoS One. 10 (11), e0142974 (2015).
- Gignac, P. M., O’Brien, H. D., Sanchez, J., Vazquez-Sanroman, D. Multiscale imaging of the rat brain using an integrated diceCT and histology workflow. Brain Structure & Function. 226 (7), 2153-2168 (2021).
- Wong, M. D., Spring, S., Henkelman, R. M. Structural stabilization of tissue for embryo phenotyping using micro-CT with iodine staining. PLoS One. 8 (12), e84321 (2013).
- Barbeito-Andrés, J., et al. Congenital Zika syndrome is associated with maternal protein malnutrition. Science Advances. 6 (2), (2020).
- Handschuh, S., Glösmann, M. Mouse embryo phenotyping using X-ray microCT. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 949184 (2022).
- Turnbull, D. H., Mori, S. MRI in mouse developmental biology. NMR in Biomedicine. 20 (3), 265-274 (2007).
- Qiu, L. R., et al. Mouse MRI shows brain areas relatively larger in males emerge before those larger in females. Nature Communications. 9, 2615 (2018).
- Lerch, J. P., Sled, J. G., Henkelman, R. M. MRI phenotyping of genetically altered mice. Methods in Molecular Biology. 711, 349-361 (2011).
- Gonzalez, P. N., Kristensen, E., Morck, D. W., Boyd, S., Hallgrímsson, B. Effects of growth hormone on the ontogenetic allometry of craniofacial bones. Evolution & Development. 15 (2), 133-145 (2016).
- Metscher, B. D. MicroCT for developmental biology: a versatile tool for high-contrast 3D imaging at histological resolutions. Developmental Dynamics. 238 (3), 632-640 (2009).
- Vickerton, P., Jarvis, J., Jeffery, N. Concentration-dependent specimen shrinkage in iodine-enhanced microCT. Journal of Anatomy. 223 (2), 185-193 (2013).
- Dawood, Y., et al. Reducing soft-tissue shrinkage artefacts caused by staining with Lugol’s solution. Scientific Reports. 11, 19781 (2021).
