Imaging micro-CT e analisi morfometrica del cervello neonatale del topo

L’imaging con tomografia microcomputerizzata (micro-CT) è uno strumento prezioso per diversi campi di ricerca. In biologia, è particolarmente adatto per la ricerca sulle ossa a causa dell’assorbimento dei raggi X nei tessuti mineralizzati. A causa di questa caratteristica, diverse questioni riguardanti lo sviluppo osseo¹, il metabolismo² e l’evoluzione ^3,4, tra gli altri argomenti, sono state affrontate con l’assistenza della micro-TC. Nel 2008, de Crespigny et ^al.5 hanno dimostrato che le immagini micro-CT di cervelli adulti di topi e conigli potevano essere ottenute utilizzando lo iodio come agente di contrasto. Questo lavoro ha aperto una nuova applicazione per questa tecnica di imaging, poiché lo iodio ha permesso l’acquisizione di immagini da tessuti molli che altrimenti sarebbero stati insensibili ai raggi X. Pertanto, l’obiettivo generale della combinazione di micro-TC e di un mezzo di contrasto a base di iodio è quello di ottenere immagini ad alta risoluzione, in cui i tessuti molli possano essere distinti e identificati a livello meso o macro anatomico.

Questa tecnica ha un notevole potenziale per studi che richiedono una dettagliata caratterizzazione fenotipica ex vivo di piccoli campioni, come gli embrioni di topo, che sono ampiamente utilizzati nei disegni sperimentali⁶. Il mezzo di contrasto con iodio in combinazione con l’imaging micro-CT è stato utilizzato per ottenere quantificazioni volumetriche degli organi⁷ e delle strutture tridimensionali (3D)^{di riferimento 8,9}. Negli ultimi anni, la scansione micro-CT di campioni colorati è stata applicata per descrivere le caratteristiche fenotipiche cerebrali dei roditori¹⁰ e sono stati proposti diversi miglioramenti alla tecnica. Per i cervelli adulti, un protocollo di 48 ore di immersione nello iodio, con una precedente fase di perfusione con un idrogel, è risultato produrre immagini di alta qualit๹. Gignac et ^al.12 hanno ampliato i limiti di questa tecnica dimostrando che i cervelli di ratto colorati con iodio potevano essere processati per eseguire tecniche istologiche di routine. Allo stesso modo, queste procedure dimostrano risultati promettenti per i cervelli di roditori embrionali e pre-svezzamento 8,13,14,15.

Sebbene le neuroscienze abbiano ampiamente applicato tecniche basate sul microscopio per valutare diversi aspetti strutturali e funzionali dello sviluppo del cervello, tali studi sono più adatti per caratterizzare specifiche popolazioni cellulari o strutture spazialmente limitate. Al contrario, l’imaging micro-CT consente la descrizione di intere strutture e l’acquisizione di modelli 3D che conservano informazioni spaziali rilevanti, complementari alle tecniche microscopiche. La risonanza magnetica per immagini (MRI) è anche una tecnica standard applicata per esplorare le caratteristiche strutturali dei piccoli animali 16,17,18. Tuttavia, la micro-CT, con l’uso di un mezzo di contrasto, presenta due vantaggi principali per i campioni fissi ex vivo: gli scanner micro-CT sono in gran parte meno costosi e facili da usare, e consentono una risoluzione spaziale più elevata rispetto alla MRI¹².

Questo lavoro ha lo scopo di descrivere la procedura per ottenere immagini ad alta risoluzione dal cervello di topo neonatale utilizzando la scansione micro-CT dopo la colorazione con la soluzione di Lugol, un agente di contrasto a base di iodio. Viene presentato un protocollo completo, che inizia con le fasi preliminari come la raccolta del campione e la fissazione dei tessuti, e passa attraverso la colorazione, l’acquisizione di immagini micro-CT e l’elaborazione standard. L’elaborazione delle immagini include la segmentazione di un volume 3D dell’intera testa, così come del cervello, e la selezione di piani anatomici specifici per digitalizzare le coordinate dei punti che potrebbero poi essere utilizzate nelle analisi morfometriche. Sebbene l’attenzione si concentri sul cervello neonatale del topo, strategie simili possono essere applicate ad altri tessuti molli. Pertanto, il protocollo qui presentato è abbastanza flessibile da poter essere applicato, con lievi modifiche, ad altri tipi di campioni.