ラットモデルにおける低強度集束超音波を用いた脊髄バリアの破壊

すべての動物実験は、ジョンズ・ホプキンス大学動物実験委員会(IACUC RA20M223)に従って承認され、実施されました。本研究では、Sprague-Dawley雌ラット(平均体重:250 g、年齢:11週間)のみを使用しました。 1.低強度集束超音波の組み立てとセットアップ ラットでBSCB開口を達成するのに十分な仕様の集束超音波トランスデューサーシステムを入手します。文献から推奨されるパラメータには、0.25〜4 MHzの中心周波数と、0.2〜2.1 MPa、10、14、15、16、17の間のピーク圧力を生成する能力が含まれます。システムに駆動/制御機器(少なくとも波/信号発生器、無線周波数(RF)駆動/電力増幅器、およびマッチングネットワークが含まれていることを確認します(図2A)。注:ここで説明するセットアップでは、中心周波数250 kHz、直径64 mmの市販の多振動子型探触子を使用します(図2B)。 3Dプリントしたプローブホルダーとウォーターコーンをトランスデューサーに取り付けます(図2C)。コーンとトランスデューサーの間の水密シールを確保してください。注:カスタムコーンとプローブホルダーは、この実験で使用したトランスデューサーに付属しています。コーンとプローブホルダーは、ネジでトランスデューサに固定されていますが、これも付属しています。 厚さ50μmの音響透過性ポリエステルメンブレンを滅菌し、輪ゴムを使用してウォーターコーンの底に貼り付けます。 入口と出口のチューブを使用して、脱気および脱イオン水でウォーターコーンを満たします。コーン内の気泡は、探触子とターゲットの間の音響結合を乱す可能性があるため、避けるように注意してください。ポリエステルメンブレンは少し膨らませる必要があります。注意: コーンから気泡を取り除くには、入口バルブからコーンに水を入れながら、気泡を出口バルブに導きます。小さな気泡が多数ある場合は、すべてのバルブを閉じ、大きな気泡が1つ残るまで円錐を回転させます。この気泡を出口バルブに導き、コーンの充填を再開します。 波動発生器とRF駆動アンプを含む駆動機器をトランスデューサーに接続します。トランスデューサケーブルはマッチングネットワークの出力側に接続し、信号発生器/パワーアンプはマッチングネットワークの入力側に接続します。ケーブルは、対応するチャネル番号に接続する必要があります(図2D-G)。注:この研究で使用した商用システムでは、波動発生器とRF駆動アンプはトランスデューサの電力出力(TPO)のコンポーネントです(図2D)。 プローブホルダーを定位アームに取り付けます。定位アームを固定プレートアセンブリに取り付けます。これにより、超音波処理中にトランスデューサーをげっ歯類の上に正確に配置することができます。 2.動物の調製と外科的椎弓切除術 イソフルランと医療用空気の混合物でラットを、木炭フィルターキャニスターに取り付けられた誘導チャンバーで麻酔します。麻酔導入のために、ガス流量を400 mL / minに設定し、イソフルラン気化器を1.5%〜2.5%に設定します。完全な鎮静の前にチャンバーで費やされる時間はさまざまですが、通常は3〜6分の範囲です。. 鎮静したラットの体重を記録し、つま先をつまむテストを実行します。つまみに反応してけいれんや動きが観察された場合は、ラットをさらに1分間誘導チャンバー内に戻し、つま先のつまみテストを繰り返します。ラットが完全に麻酔されていることを確認するために、必要に応じて繰り返します。. 加熱パッドと滅菌吸収パッドを固定プレートに置きます。ラットを吸収パッドの上に置き、眼軟膏を塗布し、直腸体温計を置いて体温を監視します。注:外科的処置の間、ラットの体温と心拍数を監視する必要があります(理想的には、心拍数は330〜480 bpm、温度は35.9〜37.5°Cである必要があります)18,19。イソフルランまたは加熱パッドを適宜調整して、早期死亡を防ぎます。加熱パッドは37°C前後の温度に設定でき、最適な体温を維持するために必要に応じてオンとオフを切り替える必要があります。 第13胸椎(T13)の脊椎に付着しているラットの最後の肋骨を触診します。電気カミソリを使用して、最後の肋骨と首の間の背側表面の毛皮を剃ります。露出した皮膚を10%ヨードポビドンに浸したガーゼで拭きます。 虹彩はさみを使用して正中線切開を作成し、棘突起と椎弓が露出するまで筋膜を解剖します。脊髄が露出するまで、オフセットボーンニッパーと角度付きブレードアイリスハサミで骨を取り除きます20。椎弓切除術と切開の長さは、超音波処理されるさまざまなターゲットの数によって異なります。この研究では、3cmの切開を使用して3段階の椎弓切除術が行われました。注意: 怪我を防ぐために、骨を取り除くときは脊髄に触れたり、脊髄に圧力をかけたりしないでください。椎弓切除術中にラットの後肢がけいれんする場合は、臍帯または神経根に過度の力がかかりすぎます。 椎弓切除術に隣接する有棘突起をクランプすることにより、ラットを固定プレートに固定します。クランプをロックする前に、背骨を少しぴんと張って湾曲を最小限に抑えます。 3. レーザー誘導によるターゲット位置推定 トランスデューサーの位置を定位アームで調整し、椎弓切除術の真上に位置するようにします(図3A)。フレームは、x軸、y軸、z軸の動き、垂直面での180°回転、水平面での360°回転を可能にします。 ウォーターコーンの底にレーザー装置を取り付け、レーザーポイントが見えるまで下げます。レーザーポイントがBSCB破壊のターゲットである位置より上になるまで、探触子の横方向の位置を調整します(図3B、C)。メモ: レーザー装置のコンピューター支援設計 (CAD) ファイルは、補足セクションに含まれています (補足図 1)。 レーザー装置を取り外し、コーンと脊髄の間の空間を脱気した超音波ゲルで満たします(図3D)。カップリングを最大にするには、ゲル内に気泡がないことを確認してください。注:この研究では、ウォーターコーンを取り付けたトランスデューサーを、コードから1cm上に位置するまで下げました。ウォーターコーンの長さは30mmだったので、探触子からコードまでの総距離は40mmでした。ウォーターコーンを脊髄から1cm離して配置したのは、切開部の両側にあるラットの皮膚、筋膜、筋肉組織が、コーンの先端と脊髄の直接接触を妨げているからである。定位アームのy軸の数字を使用すると、特にゲルによってコーンとコードまでの距離を視覚的に確認することが困難になるため、コーンがコードから1cm離れている垂直距離を追跡するのに役立つ場合があります。 TPOで超音波処理のパラメータを設定します。BSCBの中断を成功させるために、さまざまな値を使用できます。最大の出力を得るには、超音波処理周波数をトランスデューサーの中心周波数に近づけて設定します。この調査で使用した値を 表1に示します。注:ここに記載されているパラメータは、げっ歯類の脊髄21を安全に神経調節するために、中心周波数500kHz、トーンバースト持続時間500μs、デューティサイクル50%、超音波処理時間5または10分で、LIFUとの以前の研究から適応されました。BSCB破壊を首尾よく達成した研究に基づいて、使用できる他のパラメータは、500 kHz〜1 MHzの中心周波数、0.2〜2.1 MPaの圧力、10〜25 msのバースト長、および2〜5分の超音波処理時間6,10,11,22です。 パラメーター 価値 周波数 (kHz) 250 焦点距離(mm) 40 音響ピーク圧力(MPa) 0.47 デューティサイクル 40% バースト長 (ミリ秒) 400 期間 1 超音波処理時間(分) 5 表1:BSCB破壊に使用される超音波処理パラメータ。 4. マイクロバブル投与 製造元の指示に従ってMB溶液を準備します。溶液に空気を入れないでください。注:MBは壊れやすく、数分間静止させるとバイアル/シリンジの上部近くで固まります。バイアルとシリンジを定期的に振って、MBの不均一な分散を防ぎます。製造元のガイドを参照して、有効期限を確認してください。 22 G尾静脈カテーテルを挿入し、0.2 mLのヘパリン化生理食塩水(500 IU / mL)でフラッシュします23。尾静脈カテーテル検査が成功する可能性を高めるには、尾部を温水に浸し、尾部の付け根に止血帯を装着して静脈の直径を拡大します。注:尾静脈カテーテル検査は、動物の椎弓切除術、ポジショニング、およびターゲティングの前に実施して、研究時間を節約できます。 1 mL/kg の 3% EBD をカテーテルに注入します。0.2 mLのヘパリン化生理食塩水で洗い流します。ネズミの四肢と目が青くなります。ラットの背側脊髄静脈の青色の変化をチェックして、尾静脈カテーテル検査が成功したことを確認します(図4)。注:EBDはMB注射のかなり前に注入することができ、超音波処理に影響を与えません。さらに、食品医薬品局(FDA)は現在、すでにシステム内にある薬物による超音波処理を承認していないため、超音波処理後にEBDを投与することもできます。これにより、色素の取り込みは少なくなりますが、臨床的に関連する可能性があります。 0.2 mLのMBボーラスをカテーテルに注入し、0.2 mLのヘパリン化生理食塩水でフラッシュします。MBの注入の1〜2分後に超音波処理を開始します。ここで使用されるセットアップは、リアルタイムの超音波処理フィードバックを収集しません。注:BSCB破壊の研究では、通常、画像診断で示されるよりも高濃度のMBが使用されます。ラットモデルでBBBおよびBSCB破壊に使用される一般的なMBブランドの濃度には、0.02〜0.2 mL / kgおよび200μLのボーラスが含まれます10、15、24、25。 5.脊髄抽出と組織処理 超音波処理の完了後、血液が完全に透明になるまで、ラットに100mLの冷たいリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を経心灌流します。染料のために濃い青色である肝臓は、淡い茶色がかった青色に退色するはずです26。注:灌流の目的は、脊髄の血管系から余分な血液を取り除くことです。EBDはアルブミンに結合するため、過剰なEBDも除去されます。これにより、脊髄で目視または蛍光顕微鏡で検出されるEBDは、脊髄実質への色素の血管外漏出によるものであることが保証されます。 100 mLの冷たい4%パラホルムアルデヒド(PFA)を経心灌流します。.ラットの手足は、この固定中に完全に行われると痙攣します。このPFAの灌流はラットを安楽死させます。 脊髄を切除し、4%PFAに4°Cで一晩浸します。翌日、PFAをPBSに交換します。 6. BSCBディスラプションの可視化 かみそりの刃を使用して超音波処理の場所を囲む2cmのセクションを分離します。切片をブレードで正中線に沿って分割し、ミクロトームを使用して切片を厚さ10μmの切片に分割します。明視野の可視化には、ヘマトキシリン-エオシン(H&E)染色で染色します。注:この研究で示されたH&E脊髄サンプルは、ヘマトキシリンで3分間、エオシンで1分間染色されました27。 蛍光顕微鏡では、脊髄切片を含むスライドを脱パラフィンし、封入剤(0.5 μg/mL)に溶解した25 μLの4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)で対比染色します。4°Cで10分以上インキュベートします。漂白を防ぐため、光を避けてください。注:脱パラフィン処理は、凍結切片を得るためにクライオスタットを使用することで置き換えることができます。 蛍光顕微鏡を使用して、すべてのスライドを画像化します。EBD自家蛍光(励起:470 nmおよび540 nm、発光:680 nm)は赤チャンネルに、DAPIは青チャンネルに存在します。光学顕微鏡を使用してH&Eスライドを画像化します。注:このプロトコルは非生存手順を説明していますが、生存手術技術を使用しても行われました。サバイバル手術では、切開前にヨードポビドンを3回交互に塗布して皮膚を消毒し、手術前にブプレノルフィンを皮下投与(0.05mg/kg)します。術後少なくとも3日間は12時間ごとに皮下ブプレノルフィンを提供し続け、ラットに痛みの兆候が見られる場合はさらに数日かかります。.脊髄損傷が発生すると、ラットは尿閉や異常な歩行を示すことがあります。これは、後肢の引きずったり、動きが遅れたり、触知できる膀胱が膨らんだりします。これが発生した場合は、餌と水分補給のために栄養を強化した水ジェルを飼いネズミに与え、反射排尿が回復するまで1日2回手動で膀胱を搾乳します。後肢の完全な麻痺または難治性の痛みがある場合は、ラットを安楽死させます。