A ruptura da barreira hemato-medular (BSCB) pode ser alcançada com sucesso com a administração intravenosa de microbolhas e a aplicação de ultrassom focalizado de baixa intensidade (LIFU). Este protocolo detalha a abertura do BSCB usando LIFU em um modelo de roedor, incluindo a configuração do equipamento, injeção de microbolhas, localização do alvo e visualização da interrupção do BSCB.
O ultrassom focalizado de baixa intensidade (LIFU) usa pulsações ultrassônicas em intensidades mais baixas do que o ultrassom e está sendo testado como uma tecnologia neuromoduladora reversível e precisa. Embora a abertura da barreira hematoencefálica mediada por LIFU (BHE) tenha sido explorada em detalhes, nenhuma técnica padronizada para a abertura da barreira hematoencefálica (BSCB) foi estabelecida até o momento. Portanto, este protocolo apresenta um método para o sucesso da ruptura da BSCB usando a sonicação de LIFU em um modelo de rato, incluindo descrições da preparação animal, administração de microbolhas, seleção e localização do alvo, bem como visualização e confirmação da interrupção da BSCB. A abordagem relatada aqui é particularmente útil para pesquisadores que precisam de um método rápido e econômico para testar e confirmar a localização do alvo e a interrupção precisa do BSCB em um modelo animal pequeno com um transdutor de ultrassom focado, avaliar a eficácia do BSCB dos parâmetros de sonicação ou explorar aplicações para LIFU na medula espinhal, como a liberação de drogas, imunomodulação e neuromodulação. Recomenda-se otimizar esse protocolo para uso individual, especialmente para avançar futuros trabalhos pré-clínicos, clínicos e translacionais.
Assim como a barreira hematoencefálica (BHE), a barreira hematoencefálica (BCB) regula o movimento de solutos, células e componentes plasmáticos circulantes para o parênquima espinhal1. Essa característica protetora é o resultado de um sistema especializado de células endoteliais não fenestradas e firmemente ligadas que revestem os capilares espinhais2. Tipicamente, apenas moléculas lipofílicas de baixo peso e carga positiva podem atravessar ambas as barreiras3. Apesar de estudos sugerirem que a BSCB tem uma permeabilidade ligeiramente maior que a BBB, ambas as barreiras limitam a entrega da terapêutica ao sistema nervosocentral4. Várias estratégias têm sido desenvolvidas para aumentar o transporte de fármacos através da BSCB, incluindo técnicas para aumentar a pressão osmótica nos capilares espinhais, o desenvolvimento de fármacos que interagem com receptores de bradicinina e a criação de nanopartículas funcionalizadas5.
A ruptura da BSCB também pode ser obtida por meio da administração intravenosa de microbolhas (MBs) seguida de sonicação de ultrassom focalizado de baixa intensidade (LIFU)6. O campo acústico gerado pelo transdutor de ultrassom provoca oscilações de MB que, por sua vez, exercem tensão contra a parede endotelial e afrouxam as tight junctions7. O afrouxamento das tight junctions cria lacunas transitórias nos capilares, permitindo que a terapêutica penetre no parênquima espinhal (Figura 1). Esse processo também pode criar fenestrações transendoteliais, aumentar a transcitose e diminuir a regulação dos transportadores de de ligação ao ATP, como a glicoproteína P 8,9. Um dos principais benefícios dessa técnica é a capacidade de minimizar os efeitos fora do alvo, direcionando a região focal de sonicação para o local de interesse na medula espinhal. Vários ensaios clínicos investigaram a eficácia da abertura BBB mediada por LIFU para o tratamento de patologias do sistema nervoso central, incluindo gliomas, esclerose lateral amiotrófica, doença de Alzheimer e doença de Parkinson. Embora a interrupção da BSCB mediada pela LIFU não seja tão extensivamente caracterizada como a interrupção da BSCB mediada pela LIFU, vários grupos relataram a interrupção bem-sucedida da BSCB em modelos de roedores, coelhos e suínos10,11,12. Em geral, o interesse pela técnica está crescendo rapidamente, especialmente como uma via viável para a liberação de drogas.
Neste protocolo, uma técnica para ruptura da BSCB mediada por LIFU em um modelo de rato é descrita. O procedimento inclui descrições detalhadas da preparação dos animais, configuração do equipamento LIFU, administração de AM, localização do alvo e extração da medula espinhal. A confirmação da localização do alvo e da ruptura da BSCB é avaliada por meio do extravasamento do corante azul de Evans (EBD) para a medula espinhal. A EBD é um composto atóxico que se liga à albumina sérica e pode ser identificada visualmente por sua rica cor azul e autofluorescência vermelha à microscopia13.
As etapas listadas aqui oferecem uma alternativa rápida e barata aos sistemas LIFU guiados por ultrassom (US) ou ressonância magnética (RM) tradicionais. Como resultado, este método é útil para pesquisadores interessados em testar e confirmar rapidamente as capacidades de direcionamento e interrupção do BSCB de seu transdutor LIFU antes de adquirir equipamentos e materiais adicionais ou buscar aplicações de LIFU na medula espinhal, como entrega de drogas, imunomodulação e neuromodulação.
Aqui, os equipamentos e as etapas necessárias para a interrupção efetiva e direcionada da BSCB usando ultrassom focalizado de baixa intensidade (LIFU) combinado com a administração de microbolhas (MB) são descritos. Este protocolo é flexível e pode ser otimizado para uso individual com transdutores de especificações variadas. Outras técnicas para a ruptura da BSCB mediada por LIFU dependem do uso de sistemas guiados por ressonância magnética (RM) para localização do alvo, que é um recurso dispendioso16. As vantagens da técnica aqui apresentada residem na rápida confirmação visual em tempo real da ruptura da BSCB e na facilidade de direcionamento devido à natureza aberta do procedimento. Além disso, o aparelho a laser é simples de usar e construir, e um arquivo CAD está incluído na seção suplementar. Como resultado, os pesquisadores interessados em conduzir testes iniciais sobre as capacidades de direcionamento de seu transdutor LIFU em um modelo animal pequeno podem usar este protocolo como uma ferramenta para confirmar rapidamente o posicionamento da zona focal sobre um local de interesse. Essa técnica também pode ser usada por laboratórios que começam a estudar aplicações clínicas de LIFU, como a liberação de medicamentos, antes de investir em modalidades de orientação mais complexas, como sistemas de US ou RM. Atualmente, as modalidades guiadas por US apresentam um caminho mais promissor e custo-efetivo em comparação aos sistemas de RM, embora estes últimos sejam mais frequentemente vistos na literatura.
Existem várias etapas críticas neste procedimento que devem ser cuidadosamente executadas para garantir o sucesso da interrupção do BSCB. É imperativo evitar pressão desnecessária sobre a medula espinhal durante a laminectomia cirúrgica. O excesso de manipulação física do cordão aumenta a probabilidade de danos ao BSCB. O dano aparece como uma mancha marrom escura dentro do cordão umbilical após a extração devido à hemorragia e ao extravasamento acentuado de EBD. Além disso, o acoplamento máximo deve ser assegurado entre o transdutor e a medula espinhal exposta. Como resultado, deve-se tomar cuidado para remover bolhas do cone de água e gel de ultrassom. Não deve haver espaços entre o fundo do cone de água e o cabo para garantir a transmissão total da onda acústica. Durante o cateterismo da veia caudal, deve-se evitar a passagem acidental de ar junto com as soluções salinas heparinizadas, EBD ou MB. A injeção de ar aumenta muito a chance de uma embolia pulmonar que resulte em morte de roedores antes da conclusão do procedimento28.
Um problema comum que pode ser encontrado durante este procedimento é a falha da injeção de EBD bem-sucedida. Para indivíduos com experiência mínima em cateterismo da veia caudal, realizar essa etapa antes da laminectomia, posicionamento ou direcionamento do animal economizará tempo. A EBD também pode ser injetada bem antes da injeção de MB sem influenciar a sonicação. A utilização do torniquete e do banho de água morna sugeridos neste protocolo ajudará a dilatar as veias da cauda e aumentar a taxa de sucesso. Além disso, a desidratação do rato reduz a probabilidade de colocação correta do cateter. Uma injeção intraperitoneal de soro fisiológico 10-15 minutos antes da cateterização da veia caudal pode ajudar. Durante o cateterismo, deve-se iniciar 2 em acima da extremidade da cauda e mover-se no sentido caudal para cranial. Mover-se na direção oposta diminui a probabilidade de sucesso devido ao potencial colapso da veia ou hemorragia.
Outro desafio comum envolve a ausência de extravasamento de EBD apesar da sonicação. Isso pode indicar que os parâmetros que estão sendo usados para sonicação são insuficientes para a interrupção do BSCB. Por exemplo, se a frequência de sonicação é definida em um valor que difere muito da frequência central do transdutor, a potência de sonicação será muito baixa para oscilar MBs e causar afrouxamento da junção apertada. Além disso, quanto mais interfaces entre o transdutor e o cabo (por exemplo, cone de água, membrana, gel, bolhas de ar em água/gel), menor será a verdadeira intensidade de sonicação no alvo. Minimizar essas interfaces, como usar gel desgaseificado e remover completamente as bolhas dentro do cone, ajudará a transmitir todo o potencial da sonicação. O protocolo também incentiva o aumento do tempo entre a sonicação e a perfusão para permitir mais tempo para o extravasamento da EBD para o parênquima espinhal. Embora a ruptura do BSCB seja um procedimento transitório, as lacunas estão presentes por várias horas antes do fechamento. Um longo tempo de espera aumenta a exposição ao isoflurano, mas também resulta em maior extravasamento de EBD no cordão. Alternativamente, o extravasamento de EBD pode estar presente, apesar de não haver sonicação com LIFU. Para solucionar esse problema, deve-se tomar cuidado durante a laminectomia para evitar qualquer dano acidental à BSCB. As soluções potenciais incluem levantar a coluna do rato durante o clampeamento para aumentar a quantidade de espaço entre as lâminas e o cordão, bem como uma laminectomia mais curta. Uma perfusão completa de PFA também reduz a coloração de fundo, removendo o sangue enriquecido com EBD da vasculatura dentro da medula espinhal. Durante a perfusão transcárdica, deve-se tomar cuidado para evitar ruptura acidental do coração, que pode resultar em vazamento de PBS ou PFA.
É importante notar que este estudo representa uma experiência de um único centro para a ruptura da BSCB mediada pela LIFU. Além disso, este protocolo não testa ou otimiza vários parâmetros de energia de sonicação e concentrações de AM. Como resultado, os pesquisadores são encorajados a investigar vários parâmetros e concentrações ao realizar essa técnica para otimizar a localização do alvo e a interrupção da BSCB para suas necessidades específicas de pesquisa, especialmente se os resultados iniciais produzirem quaisquer efeitos adversos. Grupos que gostariam de ver nenhuma mudança de temperatura, por exemplo, podem testar vários parâmetros até encontrar um conjunto que atenda a esse critério e alcançar interrupção suficiente do BSCB. Além disso, experimentos adicionais podem ser realizados para confirmar a segurança dessa técnica. Por exemplo, o tamanho das amostras pode ser aumentado, o período de sobrevida pode ser estendido e estudos de eletromiografia/análise da marcha podem ser realizados. Para sobrevidas mais longas, é importante ter em mente que alguns estudos mostram que altas doses de EBD às vezes podem causar toxicidade sistêmica crônica, portanto, uma dose mais baixa pode ser prudente29.
Outra limitação desse procedimento é a natureza invasiva da laminectomia (que é necessária para qualquer técnica que use LIFU para abertura da BSCB, uma vez que o ultrassom não pode penetrar através do osso). A natureza invasiva deste procedimento pode ser reduzida limitando a duração da laminectomia. A realização da laminectomia nas vértebras torácicas superiores, que são mais curtas e finas, pode reduzir o tempo necessário para laminectomia para menos de 10 min. Devido à natureza frágil dos MBs, bem como sua meia-vida curta, o tempo é limitado durante esse protocolo. A injeção de MBs deve ocorrer 1-2 minutos antes do tratamento com LIFU, e novos MBs devem ser administrados antes de cada sonicação se vários tratamentos com LIFU estiverem sendo realizados. Para experimentos envolvendo interrupção da BSCB para vários ratos, vários frascos MB podem precisar ser preparados. Como as microbolhas são caras, a alteração do fluxo de trabalho cirúrgico para minimizar o tempo entre as sonicações é preferível para conservar o número de MB usados.
A técnica aqui descrita destina-se principalmente ao uso como protocolo de pesquisa. Embora o aparelho de mira a laser não substitua as modalidades tradicionais de direcionamento em todos os cenários clínicos, ele pode ser útil em outras situações. Para cirurgias não invasivas, as modalidades tradicionais de RM podem ser usadas de forma confiável para segmentação30. Para cirurgias invasivas que incluem uma laminectomia sendo realizada, o aparelho de ponto laser descrito neste protocolo pode ser usado para localizar rapidamente o centro da zona focal de sonicação sobre uma região específica (por exemplo, um tumor ou um local de lesão medular) para fins de liberação de drogas ou terapia imunomoduladora, complementando qualquer orientação de RM que esteja ocorrendo.
De modo geral, este protocolo descreve uma técnica eficaz e bem-sucedida para a ruptura do BSCB e inclui várias opções para confirmação da abertura do BSCB, tanto em tempo real quanto no pós-processamento. Com a BSCB funcionando como uma barreira à entrada no parênquima medular, a ruptura da BSCB é um método possível para melhorar a entrega da terapêutica. Weber-Adrian e col., por exemplo, utilizaram LIFU com frequência de 1,114 MHz e comprimento de burst de 10 ms para mediar a liberação gênica para a coluna cervical6. Da mesma forma, Smith e col. mostraram que LIFU com frequência de 580 kHz, pressões médias de pico acústico em torno de 0,46 MPa e comprimento de ruptura de 10 ms poderiam auxiliar na entrega de um anticorpo monoclonal, o trastuzumabe, à medula espinhal em um modelo de metástases leptomeníngeas em roedores10. A maioria dos estudos tem se concentrado na utilização de LIFU, em vez de HIFU, devido à capacidade do LIFU de permeabilizar transitoriamente o BSCB, evitando danos ao tecido subjacente. Normalmente, o LIFU usa intensidades entre 0,125-3 W/cm 2, enquanto o HIFU usa intensidades de 100-10.000 W/cm2 ou superior31. Como resultado, o HIFU exerce seus efeitos principalmente através do aquecimento do tecido, enquanto o LIFU, com a coadministração de MBs, trabalha através de efeitos de cavitação mecânica. A coadministração de terapêutica com MBs pode resultar em maior extravasamento da droga para o parênquima espinhal, bem como o potencial de carregar MBs com droga e lisar os MB com ultrassom para liberação de drogas direcionadas.
Os parâmetros de sonicação, concentração de MB e tipo de transdutor utilizado neste estudo podem ser alterados com base nas necessidades experimentais. Por exemplo, um transdutor com uma região focal menor pode ser preferível para experimentos em que é necessário maior controle sobre o direcionamento localizado, enquanto um transdutor com maior potência pode ser usado para experimentos que exigem ruptura poderosa em um período de tempo mais curto. Devido à flexibilidade oferecida por esse protocolo, há grande potencial para uso em pesquisas pré-clínicas, clínicas e translacionais.
The authors have nothing to disclose.
Apoiado por T32GM136577 (D.R.); N660012024075 (N.T., N.V.T., A.M., K.K.L.); R01 HL139158-01A1 e R01 HL071568-15 (N.V.T.); Johns Hopkins ICTR Clinical Research Scholars Program (KL2) (A.M). Várias figuras criadas com BioRender.com.
0.9% Heparinized Sodium Chloride | Baxter | FKB0953G | Flush tail vein catheter with heparinized saline to prevent clotting. |
100 mL Luer Lock Tip Syringe (2) | Wilburn Medical | WUSA/120 | One syringe can be used to inject PBS and one for PFA (during transcardial perfusion) |
1x Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Scientific | 10010001 | For transcardial perfusion. |
22 G catheter | Med Vet International | 50-209-1694 | Use to place a tail vein catheter. |
97% Isoflurane | Thermo Scientific Chemicals | 247-897-7 | While rat is under isoflurane, be careful not to administer too much. A high dose can euthanize the rat. |
Betadine 7.5% | Purdue Products | 4677 | |
Class A clear threaded glass vial | Fisherbrand | 14-955-314 | Use to store spinal cord extraction. |
Digital balance scale | Kent Scientific | SCL-4000 | |
Electric razor | Wahl Home Products | 79449-200 | Shave fur off skin at incision site before surgery |
Eosin-Y with Phloxine | Epredia | 71304 | |
Evans blue dye | MP Biomedicals | 02151108-CF | Although it is non-toxic, it will stain skin blue if direct contact occurs. |
Fixation Plate Assembly with 0.5 mm Forceps | PSI Impactors | 7001-2 | Affix the stereotactic arm to this frame |
Gauze | Fisherbrand | 13-761-52 | |
Heating pad | Kent Scientific | RT-0515 | |
Hematoxylin | Epredia | 7211 | |
Iris Scissors with Angled Blades | ProDentUSA | 12-15315 | |
Isoflurane induction system | Kent Scientific | SOMNO-RATKIT | |
Laser targetting apparatus | NA | custom | CAD design file provided in supplemental section. Simply place a laser inside the apparatus created from the file. |
Lubricating eye ointment | Systane | N/A | |
Luer Lock 3-Way Stopcock | Sigma | SAS7521-10EA | Can use to fill water cone through inlet valve |
Lumason microbubbles kit | Bracco | 0270-7099-16 | |
Microscope cover glass | Fisherbrand | 12-545J | |
Microscope slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
Microtome | Epredia | 23-900-671 | |
Mounting medium with 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Vector Laboratories | H-2000-2 | |
Mylar membrane | Chemplex | 3016 | Can cut membrane to appropriate size if too large for cone |
NeuroFUS 2.52" diameter 250 kHz transducer | Sonic Concepts | CTX-250 | Transducer system includes custom water cone and probe holder |
NeuroFUS PRO v2.0 system | Sonic Concepts | NFS102v2 | Includes Transducer Power Output, Matching Network and associated cables |
Offset Bone Nippers | Fine Science Tools | 16101-10 | Use to remove spinous processes and laminae for laminectomy |
Paraffin | Polysciences | 24364-1 | Can place spinal cord sample in paraffin to slice into thin sections for histology. |
Paraformaldehyde (4%) | Thermo Scientific | J61899-AK | For transcardial perfusion. |
Rat Surgical Kit | Kent Scientific | INSRATKIT | Consists of tweezer #5, needle holder, McPherson-Vannas scissors, Iris scissors, ALM self-retaining retractors, Iris forceps, and blunt probe. These products should be sufficient to perform a laminectomy. |
Razor blade | Fisherbrand | 12-640 | Use to cut spinal cord extraction to desirable length and split section down midline. |
Rectal thermometer | Kent Scientific | RET-2 | Maintain rat temperature between 35.9–37.5 °C |
Rubber band | Fisherbrand | 50-205-1983 | |
Single animal vaporizer unit | Kent Scientific | SF-01 | |
Stereotactic arm | Kopf Instruments | Model 963 | |
Sterile absorbent pad | McKesson | 4033-CS150 | Place under rat and above heating pad and fixation plate before laminectomy |
Ultrasound gel | Aquasonic | PLI 01-34 | Ensure gel is free of bubbles to the best of your ability. |