הפרעה במחסום הדם-חוט השדרה (BSCB) יכולה להיות מושגת בהצלחה עם מתן תוך ורידי של מיקרו-בועות ויישום אולטרסאונד ממוקד בעוצמה נמוכה (LIFU). פרוטוקול זה מפרט את פתיחת ה- BSCB באמצעות LIFU במודל מכרסמים, כולל הגדרת ציוד, הזרקת מיקרו-בועות, לוקליזציה של מטרות והדמיית הפרעה של BSCB.
אולטרסאונד ממוקד בעוצמה נמוכה (LIFU) משתמש בפעימות על-קוליות בעוצמות נמוכות יותר מאולטרסאונד ונבדק כטכנולוגיה נוירומודולטורית הפיכה ומדויקת. למרות שפתיחת מחסום דם-מוח בתיווך LIFU (BBB) נחקרה בפירוט, לא נקבעה עד כה טכניקה סטנדרטית לפתיחת מחסום דם-חוט השדרה (BSCB). לכן, פרוטוקול זה מציג שיטה לשיבוש מוצלח של BSCB באמצעות סוניקציה LIFU במודל חולדה, כולל תיאורים של הכנת בעלי חיים, ניהול מיקרו-בועות, בחירת מטרות ולוקליזציה, כמו גם הדמיה ואישור של שיבוש BSCB. הגישה המדווחת כאן שימושית במיוחד עבור חוקרים הזקוקים לשיטה מהירה וחסכונית כדי לבדוק ולאשר לוקליזציה של מטרות ושיבוש BSCB מדויק במודל של בעלי חיים קטנים עם מתמר אולטרסאונד ממוקד, להעריך את יעילות BSCB של פרמטרים סוניים, או לחקור יישומים עבור LIFU בחוט השדרה, כגון אספקת תרופות, אימונומודולציה, ונוירומודולציה. מומלץ למטב פרוטוקול זה לשימוש אישי, במיוחד לקידום עבודה פרה-קלינית, קלינית ותרגומית עתידית.
בדומה למחסום הדם-מוח (BBB), מחסום הדם-חוט השדרה (BSCB) מווסת את התנועה של מומסים, תאים ומרכיבי פלזמה במחזור לתוך פרנכימה של עמוד השדרה1. תכונת הגנה זו היא תוצאה של מערכת מיוחדת של תאי אנדותל קשורים היטב, שאינם מגוננים, המרפדים את נימי עמוד השדרה2. בדרך כלל, רק מולקולות ליפופיליות בעלות משקל נמוך עם מטען חיובי יכולות לחצות את שני המחסומים3. למרות מחקרים המצביעים על כך של- BSCB יש חדירות מעט גבוהה יותר מאשר ל- BBB, שני המחסומים מגבילים את מתן התרופות למערכת העצבים המרכזית4. מספר אסטרטגיות פותחו כדי להגביר את העברת התרופות ברחבי BSCB, כולל טכניקות להגברת הלחץ האוסמוטי בנימי עמוד השדרה, פיתוח תרופות המקיימות אינטראקציה עם קולטני ברדיקינין, ויצירת ננו-חלקיקים פונקציונליים5.
הפרעה BSCB יכולה להיות מושגת גם באמצעות מתן תוך ורידי של מיקרו-בועות (MBs) ואחריו סוניקציה של אולטרסאונד ממוקד בעוצמה נמוכה (LIFU)6. השדה האקוסטי שנוצר על ידי מתמר האולטרסאונד גורם לתנודות MB, שבתורן מפעילות לחץ על דופן האנדותל ומשחררות צמתים הדוקים7. התרופפות הצומת ההדוקה יוצרת רווחים חולפים בנימים, ומאפשרת למטפלים לחדור לתוך הפרנכימה של עמוד השדרה (איור 1). תהליך זה יכול גם ליצור fenestrations transendothelial, להגביר transcytosis, ו downregullate ATP קושרים קולטות טרנספורטרים, כגון P-glycoprotein 8,9. יתרון מרכזי של טכניקה זו הוא היכולת למזער השפעות מחוץ למטרה על ידי הכוונת אזור המוקד של סוניקציה למיקום העניין בחוט השדרה. מספר ניסויים קליניים בדקו את היעילות של פתיחת BBB בתיווך LIFU לטיפול בפתולוגיות של מערכת העצבים המרכזית, כולל גליומות, טרשת אמיוטרופית צידית, מחלת אלצהיימר ומחלת פרקינסון. למרות ששיבוש BSCB בתיווך LIFU אינו מאופיין באופן נרחב כמו הפרעה BBB בתיווך LIFU, מספר קבוצות דיווחו על שיבוש BSCB מוצלח במודלים של מכרסמים, ארנבים וחזירים10,11,12. בסך הכל, העניין בטכניקה גדל במהירות, במיוחד כאפיק בר קיימא לאספקת תרופות.
בפרוטוקול זה מתוארת טכניקה להפרעה BSCB בתיווך LIFU במודל חולדה. ההליך כולל תיאורים מפורטים של הכנת בעלי חיים, הגדרת ציוד LIFU, ניהול MB, לוקליזציה של מטרות ועקירת חוט השדרה. אישור של לוקליזציה של המטרה ושיבוש BSCB מוערך באמצעות אקסטרווזיה של צבע כחול אוונס (EBD) לתוך חוט השדרה. EBD היא תרכובת לא רעילה שנקשרת לאלבומין בסרום וניתן לזהות אותה על ידי צבעה הכחול העשיר באופן חזותי ואוטופלואורסצנטיות אדומה תחת מיקרוסקופ13.
השלבים המפורטים כאן מציעים חלופה מהירה וזולה למערכות LIFU מונחות אולטרסאונד מסורתיות (US) או תהודה מגנטית (MR). כתוצאה מכך, שיטה זו שימושית עבור חוקרים המעוניינים לבדוק ולאשר במהירות את יכולות המיקוד ושיבוש BSCB של מתמר LIFU שלהם לפני רכישת ציוד וחומרים נוספים או רודפים אחר יישומי LIFU בחוט השדרה, כגון אספקת תרופות, אימונומודולציה ונוירומודולציה.
כאן מתוארים הציוד והצעדים הדרושים להפרעה יעילה וממוקדת של BSCB באמצעות אולטרסאונד ממוקד בעוצמה נמוכה (LIFU) בשילוב עם מתן מיקרו-בועות (MB). פרוטוקול זה גמיש וניתן לייעל אותו לשימוש אישי עם מתמרים בעלי מפרטים שונים. טכניקות אחרות לשיבוש BSCB בתיווך LIFU מסתמכות על שימוש במערכות מונחות דימות תהודה מגנטית (MRI) ללוקליזציה של מטרות, שהוא משאב יקר16. יתרונות הטכניקה המוצגת כאן טמונים באישור חזותי מהיר בזמן אמת של שיבוש BSCB וקלות המיקוד בשל אופיו הפתוח של ההליך. יתר על כן, מכשיר הלייזר פשוט לשימוש ולבנייה, וקובץ CAD כלול בחלק המשלים. כתוצאה מכך, חוקרים המעוניינים לבצע בדיקות ראשוניות על יכולות המיקוד של מתמר LIFU שלהם במודל של בעלי חיים קטנים יכולים להשתמש בפרוטוקול זה ככלי לאישור מהיר של מיקום אזור מוקד מעל מיקום מעניין. טכניקה זו עשויה לשמש גם מעבדות המתחילות לחקור יישומים קליניים של LIFU, כגון אספקת תרופות, לפני השקעה בשיטות הנחיה מורכבות יותר כמו מערכות US או MR. נכון לעכשיו, שיטות מונחות ארה”ב מציגות נתיב מבטיח וחסכוני יותר בהשוואה למערכות MR, אם כי האחרונות נראות לעתים קרובות יותר בספרות.
ישנם מספר שלבים קריטיים בהליך זה שיש לבצע בזהירות כדי להבטיח הפרעה מוצלחת של BSCB. זה הכרחי כדי למנוע הפעלת לחץ מיותר על חוט השדרה במהלך למינקטומיה כירורגית. מניפולציה פיזית רבה מדי של הכבל מגדילה את הסבירות לנזק ל- BSCB. הנזק מופיע ככתם חום כהה בתוך החוט לאחר החילוץ עקב דימום ואקסטרווזיה מוגברת של EBD. יתר על כן, יש להבטיח צימוד מקסימלי בין המתמר לבין חוט השדרה החשוף. כתוצאה מכך, יש להקפיד להסיר בועות מחרוט המים וג’ל האולטרסאונד. לא אמורים להיות רווחים בין תחתית חרוט המים לבין הכבל כדי להבטיח שידור מלא של הגל האקוסטי. במהלך צנתור ורידי הזנב, יש להימנע מהעברת אוויר בטעות יחד עם תמיסות מי מלח, EBD או MB שעברו הפריניזציה. הזרקת אוויר מגדילה מאוד את הסיכוי לתסחיף ריאתי שיגרום למוות מכרסמים לפני סיום ההליך28.
בעיה נפוצה שעלולה להיתקל במהלך הליך זה היא כישלון של הזרקת EBD מוצלחת. עבור אנשים עם ניסיון מינימלי בצנתור ורידי זנב, ביצוע שלב זה לפני כריתת למינקטומיה, מיקום או מיקוד בעלי חיים יחסוך זמן. EBD יכול גם להיות מוזרק הרבה לפני הזרקת MB מבלי להשפיע על סוניקציה. שימוש בחוסם עורקים ובאמבט מים חמים המוצעים בפרוטוקול זה יסייע להרחיב את ורידי הזנב ולהגדיל את אחוזי ההצלחה. יתר על כן, התייבשות חולדות מפחיתה את הסיכוי למיקום נכון של הצנתר. הזרקת מי מלח תוך צפקית 10-15 דקות לפני צנתור ורידים בזנב עשויה לעזור. במהלך הצנתור יש להתחיל 2 מעל קצה הזנב ולנוע בכיוון קאודלי לגולגולתי. תנועה בכיוון ההפוך מקטינה את הסיכוי להצלחה עקב קריסת ורידים פוטנציאלית או דימום.
אתגר נפוץ נוסף קשור להיעדר אקסטרווציה של EBD למרות הסוניקציה. זה עשוי להצביע על כך שהפרמטרים המשמשים לסוניקציה אינם מספיקים להפרעה BSCB. לדוגמה, אם תדר הסוניקציה מוגדר בערך שונה מאוד מהתדר המרכזי של המתמר, עוצמת הסוניקציה תהיה נמוכה מכדי לנדנד MBs ולגרום להתרופפות צומת הדוקה. יתר על כן, ככל שיהיו יותר ממשקים בין המתמר לחוט (למשל, חרוט מים, ממברנה, ג’ל, בועות אוויר במים/ג’ל), כך עוצמת הסוניקציה האמיתית תהיה נמוכה יותר במטרה. מזעור ממשקים אלה, כגון על ידי שימוש בג’ל נטול גז והסרה יסודית של בועות בתוך החרוט, יסייע להעביר את מלוא הפוטנציאל של הסוניקציה. הפרוטוקול גם מעודד הארכת הזמן בין סוניקציה לזילוח כדי לאפשר זמן רב יותר לאקסטרווזיה של EBD לתוך פרנכימה בעמוד השדרה. למרות ששיבוש BSCB הוא הליך חולף, הפערים קיימים במשך מספר שעות לפני הסגירה. זמן המתנה ארוך מגדיל את החשיפה לאיזופלורן, אך גם גורם לאקסטרווזיה גדולה יותר של EBD בכבל. לחלופין, אקסטרווזיה EBD עשויה להיות נוכחת למרות שאין סוניקציה עם LIFU. כדי לפתור בעיה זו, יש לנקוט בזהירות במהלך כריתת הלמינקטומיה כדי למנוע נזק מקרי ל- BSCB. פתרונות אפשריים כוללים הרמת עמוד השדרה של החולדה במהלך הידוק כדי להגדיל את כמות המרווח בין הלמינה לכבל, כמו גם כריתת למינקטומיה קצרה יותר. זילוח PFA יסודי גם מפחית את כתמי הרקע על ידי הסרת דם מועשר ב- EBD מכלי הדם בתוך חוט השדרה. במהלך זילוח הלב יש להקפיד על מניעת קרע מקרי של הלב, אשר יכול לגרום לדליפה של PBS או PFA.
חשוב לציין כי מחקר זה מייצג חוויה של מרכז יחיד להפרעה BSCB בתיווך LIFU. יתר על כן, פרוטוקול זה אינו בודק או מייעל פרמטרים שונים של אנרגיית סוניקציה וריכוזי MB. כתוצאה מכך, החוקרים מעודדים לחקור פרמטרים וריכוזים שונים בעת ביצוע טכניקה זו כדי לייעל את לוקליזציה המטרה ואת שיבוש BSCB לצרכי המחקר הספציפיים שלהם, במיוחד אם התוצאות הראשוניות מייצרות תופעות לוואי כלשהן. קבוצות שרוצות שלא לראות שינויי טמפרטורה, למשל, יכולות לבדוק פרמטרים שונים עד שהן מוצאות קבוצה שעונה על קריטריון זה ומשיגה הפרעה מספקת של BSCB. יתר על כן, ניתן לערוך ניסויים נוספים כדי לאשר את הבטיחות של טכניקה זו. לדוגמה, ניתן להגדיל את גודל הדגימה, להאריך את תקופת ההישרדות, ולבצע מחקרי אלקטרומיוגרפיה / ניתוח הליכה. עבור הישרדות ארוכה יותר, חשוב לזכור כי כמה מחקרים מראים כי מינונים גבוהים של EBD יכול לפעמים לגרום רעילות מערכתית כרונית, ולכן מינון נמוך יותר עשוי להיות זהיר29.
מגבלה נוספת של הליך זה היא האופי הפולשני של כריתת הלמינקטומיה (הנדרשת לכל טכניקה המשתמשת ב- LIFU לפתיחת BSCB מכיוון שאולטרסאונד אינו יכול לחדור דרך העצם). ניתן להפחית את האופי הפולשני של הליך זה על ידי הגבלת אורך הלמינקטומיה. ביצוע כריתת הלמינקטומיה בחוליות החזה העליונות, שהן קצרות ודקות יותר, יכול להפחית את הזמן הדרוש לכריתת למינקטומיה מתחת ל -10 דקות. בשל אופיים השברירי של MBs, כמו גם מחצית החיים הקצרה שלהם, הזמן מוגבל במהלך פרוטוקול זה. הזרקת MBs צריכה להתרחש 1-2 דקות לפני הטיפול ב- LIFU, ו- MB חדשים צריכים להינתן לפני כל סוניקציה אם מבוצעים טיפולי LIFU מרובים. עבור ניסויים הכוללים הפרעה BSCB עבור חולדות מרובות, ייתכן שיהיה צורך להכין מספר בקבוקוני MB. מכיוון שמיקרו-בועות הן יקרות, עדיף לשנות את זרימת העבודה הכירורגית כדי למזער את הזמן בין הסוניקציות כדי לשמר את מספר ה-MB שבהם נעשה שימוש.
הטכניקה המתוארת כאן היא בעיקר לשימוש כפרוטוקול מחקר. למרות שמנגנון מיקוד הלייזר לא יחליף את שיטות המיקוד המסורתיות בכל ההגדרות הקליניות, הוא עשוי להיות שימושי במצבים אחרים. עבור ניתוחים לא פולשניים, שיטות MRI מסורתיות יכולות לשמש באופן אמין עבור מיקוד30. עבור ניתוחים פולשניים הכוללים כריתת למינקטומיה, ניתן להשתמש במכשיר נקודת הלייזר המתואר בפרוטוקול זה כדי למקם במהירות את מרכז אזור המוקד של סוניקציה על פני אזור מסוים (למשל, גידול או אתר של פגיעה בעמוד השדרה) למטרות מתן תרופות או טיפול אימונומודולטורי תוך השלמת כל הנחיית MR שתתרחש.
בסך הכל, פרוטוקול זה מתאר טכניקה יעילה ומוצלחת לשיבוש BSCB וכולל מספר אפשרויות לאישור פתיחת BSCB, הן בזמן אמת והן לאחר עיבוד. עם BSCB מתפקד כמחסום כניסה לתוך parenchyma חוט השדרה, הפרעה של BSCB היא שיטה אפשרית כדי לשפר את מתן הטיפולים. לדוגמה, Weber-Adrian et al. השתמשו ב- LIFU בתדר של 1.114 MHz ובאורך פרץ של 10 ms כדי לתווך העברת גנים לעמוד השדרה הצווארי6. באופן דומה, Smith et al. הראו כי LIFU עם תדר של 580 kHz, לחצי שיא אקוסטיים ממוצעים סביב 0.46 MPa, ואורך פרץ של 10 ms יכול לסייע בהעברת נוגדן חד שבטי, trastuzumab, לחוט השדרה במודל מכרסם של גרורות leptomeningeal10. רוב המחקרים התמקדו בשימוש ב- LIFU, במקום HIFU, בשל יכולתו של LIFU לחדור באופן זמני את ה- BSCB תוך הימנעות מנזק לרקמת הבסיס. בדרך כלל, LIFU משתמש בעוצמות שבין 0.125-3 W/cm 2, בעוד HIFU משתמש בעוצמות בין 100-10,000 W/cm2 ומעלה31. כתוצאה מכך, HIFU מפעיל את השפעותיו בעיקר באמצעות רקמת חימום, בעוד LIFU, עם ניהול משותף של MBs, עובד באמצעות אפקטים קוויטציה מכנית. ניהול משותף של טיפולים עם MBs יכול לגרום לאקסטרווזיה גדולה יותר של התרופה לתוך פרנכימה בעמוד השדרה, כמו גם את הפוטנציאל לטעון MBs עם תרופה וליזה MBs עם אולטרסאונד למתן תרופות ממוקד.
ניתן לשנות את פרמטרי הסוניקציה, ריכוז MB וסוג המתמר המשמשים במחקר זה בהתאם לצרכי הניסוי. לדוגמה, מתמר עם אזור מוקד קטן יותר עשוי להיות עדיף לניסויים שבהם נדרשת שליטה רבה יותר על מיקוד מקומי, בעוד שמתמר בעל הספק גבוה יותר עשוי לשמש לניסויים הדורשים הפרעה חזקה בזמן קצר יותר. בשל הגמישות שמציע פרוטוקול זה, קיים פוטנציאל גדול לשימוש במחקר פרה-קליני, קליני ותרגומי.
The authors have nothing to disclose.
נתמך על ידי T32GM136577 (D.R.); N660012024075 (נ.ט., נ.ו.ט., א.מ., ק.ק.ל.); R01 HL139158-01A1 ו-R01 HL071568-15 (N.V.T.); ג’ונס הופקינס ICTR תוכנית חוקרים קליניים (KL2) (A.M). כמה דמויות נוצרו עם BioRender.com.
0.9% Heparinized Sodium Chloride | Baxter | FKB0953G | Flush tail vein catheter with heparinized saline to prevent clotting. |
100 mL Luer Lock Tip Syringe (2) | Wilburn Medical | WUSA/120 | One syringe can be used to inject PBS and one for PFA (during transcardial perfusion) |
1x Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Scientific | 10010001 | For transcardial perfusion. |
22 G catheter | Med Vet International | 50-209-1694 | Use to place a tail vein catheter. |
97% Isoflurane | Thermo Scientific Chemicals | 247-897-7 | While rat is under isoflurane, be careful not to administer too much. A high dose can euthanize the rat. |
Betadine 7.5% | Purdue Products | 4677 | |
Class A clear threaded glass vial | Fisherbrand | 14-955-314 | Use to store spinal cord extraction. |
Digital balance scale | Kent Scientific | SCL-4000 | |
Electric razor | Wahl Home Products | 79449-200 | Shave fur off skin at incision site before surgery |
Eosin-Y with Phloxine | Epredia | 71304 | |
Evans blue dye | MP Biomedicals | 02151108-CF | Although it is non-toxic, it will stain skin blue if direct contact occurs. |
Fixation Plate Assembly with 0.5 mm Forceps | PSI Impactors | 7001-2 | Affix the stereotactic arm to this frame |
Gauze | Fisherbrand | 13-761-52 | |
Heating pad | Kent Scientific | RT-0515 | |
Hematoxylin | Epredia | 7211 | |
Iris Scissors with Angled Blades | ProDentUSA | 12-15315 | |
Isoflurane induction system | Kent Scientific | SOMNO-RATKIT | |
Laser targetting apparatus | NA | custom | CAD design file provided in supplemental section. Simply place a laser inside the apparatus created from the file. |
Lubricating eye ointment | Systane | N/A | |
Luer Lock 3-Way Stopcock | Sigma | SAS7521-10EA | Can use to fill water cone through inlet valve |
Lumason microbubbles kit | Bracco | 0270-7099-16 | |
Microscope cover glass | Fisherbrand | 12-545J | |
Microscope slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
Microtome | Epredia | 23-900-671 | |
Mounting medium with 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Vector Laboratories | H-2000-2 | |
Mylar membrane | Chemplex | 3016 | Can cut membrane to appropriate size if too large for cone |
NeuroFUS 2.52" diameter 250 kHz transducer | Sonic Concepts | CTX-250 | Transducer system includes custom water cone and probe holder |
NeuroFUS PRO v2.0 system | Sonic Concepts | NFS102v2 | Includes Transducer Power Output, Matching Network and associated cables |
Offset Bone Nippers | Fine Science Tools | 16101-10 | Use to remove spinous processes and laminae for laminectomy |
Paraffin | Polysciences | 24364-1 | Can place spinal cord sample in paraffin to slice into thin sections for histology. |
Paraformaldehyde (4%) | Thermo Scientific | J61899-AK | For transcardial perfusion. |
Rat Surgical Kit | Kent Scientific | INSRATKIT | Consists of tweezer #5, needle holder, McPherson-Vannas scissors, Iris scissors, ALM self-retaining retractors, Iris forceps, and blunt probe. These products should be sufficient to perform a laminectomy. |
Razor blade | Fisherbrand | 12-640 | Use to cut spinal cord extraction to desirable length and split section down midline. |
Rectal thermometer | Kent Scientific | RET-2 | Maintain rat temperature between 35.9–37.5 °C |
Rubber band | Fisherbrand | 50-205-1983 | |
Single animal vaporizer unit | Kent Scientific | SF-01 | |
Stereotactic arm | Kopf Instruments | Model 963 | |
Sterile absorbent pad | McKesson | 4033-CS150 | Place under rat and above heating pad and fixation plate before laminectomy |
Ultrasound gel | Aquasonic | PLI 01-34 | Ensure gel is free of bubbles to the best of your ability. |