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Bioengineering

Perturbation de la barrière hémato-épinière à l’aide d’ultrasons focalisés de faible intensité dans un modèle de rat

Published: March 10, 2023
doi:
10.3791/65113
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1Department of Neurosurgery,Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Biomedical Engineering,Johns Hopkins University, 3HEPIUS Innovation Laboratory,Johns Hopkins University School of Medicine, 4Department of Electrical Engineering and Computer Science,Johns Hopkins University, 5Department of Mechanical Engineering,Johns Hopkins University, 6Department of Anesthesiology and Critical Care Medicine,Johns Hopkins University

Summary

La perturbation de la barrière hémato-épinière (BSCB) peut être obtenue avec succès grâce à l’administration intraveineuse de microbulles et à l’application d’ultrasons focalisés de faible intensité (LIFU). Ce protocole détaille l’ouverture de la BSCB à l’aide de LIFU dans un modèle de rongeur, y compris la configuration de l’équipement, l’injection de microbulles, la localisation de la cible et la visualisation de la perturbation de la BSCB.

Abstract

Les ultrasons focalisés de faible intensité (LIFU) utilisent des pulsations ultrasoniques à des intensités inférieures à celles des ultrasons et sont testés en tant que technologie neuromodulatrice réversible et précise. Bien que l’ouverture de la barrière hémato-encéphalique (BHE) médiée par le LIFU ait été explorée en détail, aucune technique normalisée pour l’ouverture de la barrière hémato-médullaire (BSCB) n’a été établie à ce jour. Par conséquent, ce protocole présente une méthode pour une perturbation réussie de la BSCB à l’aide de la sonication LIFU dans un modèle de rat, y compris des descriptions de la préparation animale, de l’administration de microbulles, de la sélection et de la localisation de la cible, ainsi que de la visualisation et de la confirmation de la perturbation BSCB. L’approche décrite ici est particulièrement utile pour les chercheurs qui ont besoin d’une méthode rapide et rentable pour tester et confirmer la localisation de la cible et la perturbation précise de la BSCB dans un modèle animal de petite taille avec un transducteur à ultrasons focalisés, évaluer l’efficacité de la BSCB des paramètres de sonication ou explorer les applications de la LIFU au niveau de la moelle épinière, telles que l’administration de médicaments. l’immunomodulation et la neuromodulation. L’optimisation de ce protocole pour une utilisation individuelle est recommandée, en particulier pour faire progresser les futurs travaux précliniques, cliniques et translationnels.

Introduction

Semblable à la barrière hémato-encéphalique (BHE), la barrière hémato-moelle épinière (BSCB) régule le mouvement des solutés, des cellules et des composants plasmatiques circulants dans le parenchyme spinal1. Cette caractéristique protectrice est le résultat d’un système spécialisé de cellules endothéliales étroitement liées et non fenêtrées tapissant les capillaires rachidiens2. En règle générale, seules les molécules lipophiles de faible poids avec une charge positive peuvent franchir les deux barrières3. Malgré des études qui suggèrent que le BSCB a une perméabilité légèrement supérieure à celle de la BHE, les deux barrières limitent l’administration de produits thérapeutiques au système nerveux central4. Plusieurs stratégies ont été développées pour augmenter le transport des médicaments à travers le BSCB, y compris des techniques d’augmentation de la pression osmotique dans les capillaires spinaux, le développement de médicaments qui interagissent avec les récepteurs de la bradykinine et la création de nanoparticules fonctionnalisées5.

La perturbation de la BSCB peut également être obtenue par l’administration intraveineuse de microbulles (MB) suivie d’une sonication par ultrasons focalisés de faible intensité (LIFU)6. Le champ acoustique généré par le transducteur à ultrasons provoque des oscillations MB, qui à leur tour exercent une contrainte sur la paroi endothéliale et desserrent les jonctions serrées7. Le relâchement serré de la jonction crée des espaces transitoires dans les capillaires, permettant aux agents thérapeutiques de pénétrer dans le parenchyme spinal (Figure 1). Ce processus peut également créer des fenestrations transendothéliales, augmenter la transcytose et réguler à la baisse les transporteurs de cassettes de liaison à l’ATP, tels que la glycoprotéine P 8,9. L’un des principaux avantages de cette technique est la capacité de minimiser les effets hors cible en dirigeant la région focale de la sonication vers l’emplacement d’intérêt dans la moelle épinière. Plusieurs essais cliniques ont étudié l’efficacité de l’ouverture de la BHE médiée par le LIFU pour le traitement des pathologies du système nerveux central, notamment les gliomes, la sclérose latérale amyotrophique, la maladie d’Alzheimer et la maladie de Parkinson. Bien que la perturbation de la BSCB médiée par le LIFU ne soit pas aussi largement caractérisée que la perturbation de la BHE médiée par le LIFU, plusieurs groupes ont signalé une perturbation réussie de la BSCB dans des modèles de rongeurs, de lapins et de porcs10,11,12. Dans l’ensemble, l’intérêt pour cette technique augmente rapidement, en particulier en tant que voie viable pour l’administration de médicaments.

Dans ce protocole, une technique de perturbation de la BSCB médiée par LIFU dans un modèle de rat est décrite. La procédure comprend des descriptions détaillées de la préparation des animaux, de la configuration de l’équipement LIFU, de l’administration de MB, de la localisation de la cible et de l’extraction de la moelle épinière. La confirmation de la localisation de la cible et de la perturbation de la BSCB est évaluée par extravasation du colorant bleu Evans (EBD) dans la moelle épinière. L’EBD est un composé non toxique qui se lie à l’albumine sérique et peut être identifié visuellement par sa riche couleur bleue et son autofluorescence rouge en microscopie13.

Les étapes énumérées ici offrent une alternative rapide et peu coûteuse aux systèmes LIFU traditionnels guidés par ultrasons (US) ou par résonance magnétique (IRM). Par conséquent, cette méthode est utile pour les chercheurs qui souhaitent tester et confirmer rapidement les capacités de ciblage et de perturbation de la BSCB de leur transducteur LIFU avant d’acquérir des équipements et des matériaux supplémentaires ou de poursuivre des applications LIFU au niveau de la moelle épinière, telles que l’administration de médicaments, l’immunomodulation et la neuromodulation.

Protocol

Toutes les études sur les animaux ont été approuvées et menées conformément au Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux de l’Université Johns Hopkins (IACUC RA20M223). Seules des femelles adultes de Sprague-Dawley (poids moyen : 250 g ; âge : 11 semaines) ont été utilisées pour la présente étude. 1. Assemblage et configuration d’ultrasons focalisés de faible intensité Acquérir un système de transducteur à ultrasons focalisés avec des spécifications suffisantes pour obtenir l’ouverture de la BSCB chez le rat. Les paramètres suggérés dans la littérature comprennent une fréquence centrale comprise entre 0,25 et 4 MHz et la capacité de produire des pressions de pointe comprises entre 0,2 et 2,1 MPa 10,14,15,16,17. Assurez-vous que le système comprend l’équipement de commande et d’entraînement, qui comprend au moins un générateur d’ondes et de signaux, un variateur de puissance ou un amplificateur de puissance à radiofréquence (RF) et le réseau correspondant (Figure 2A).REMARQUE : La configuration décrite ici utilise un transducteur multi-éléments disponible dans le commerce avec une fréquence centrale de 250 kHz et un diamètre de 64 mm (Figure 2B). Fixez le porte-sonde et le cône d’eau imprimés en 3D sur le transducteur (Figure 2C). Assurez-vous d’une étanchéité entre le cône et le transducteur.REMARQUE : Un cône et un support de sonde personnalisés ont été inclus avec le transducteur utilisé dans cette expérience. Le cône et le porte-sonde se fixent au transducteur à l’aide de vis, qui sont également fournies. Stérilisez une membrane en polyester acoustiquement transparente de 50 μm d’épaisseur et fixez-la au fond du cône d’eau à l’aide d’un élastique. Remplissez le cône d’eau avec de l’eau dégazée et déminéralisée à l’aide des tubes d’entrée et de sortie. Veillez à éviter les bulles d’air à l’intérieur du cône, car elles peuvent perturber le couplage acoustique entre le transducteur et la cible. La membrane en polyester doit être légèrement gonflée.REMARQUE : Pour éliminer les bulles d’air du cône, guidez les bulles vers la vanne de sortie tout en remplissant le cône d’eau par la vanne d’entrée. S’il y a beaucoup de petites bulles, fermez toutes les vannes et faites tourner le cône jusqu’à ce qu’il ne reste plus qu’une grosse bulle. Guidez cette bulle jusqu’à la vanne de sortie et recommencez à remplir le cône. Connectez l’équipement d’entraînement, qui comprend le générateur d’ondes et l’amplificateur d’entraînement RF, au transducteur. Le câble du transducteur se connectera au côté de sortie du réseau correspondant, et le générateur de signal/amplificateur de puissance se connectera au côté d’entrée du réseau correspondant. Les câbles doivent être connectés à leur numéro de canal correspondant (Figure 2D-G).REMARQUE : Dans le système commercial utilisé dans cette étude, le générateur d’ondes et l’amplificateur d’entraînement RF sont des composants de la puissance de sortie du transducteur (TPO) (Figure 2D). Fixez le porte-sonde au bras stéréotaxique. Fixez le bras stéréotaxique à l’ensemble de la plaque de fixation. Cela permettra au transducteur d’être positionné précisément au-dessus du rongeur lors de la sonication. 2. Préparation de l’animal et laminectomie chirurgicale Anesthésier le rat avec un mélange d’isoflurane et d’air médical dans une chambre d’induction fixée à une cartouche filtrante à charbon. Réglez le débit de gaz à 400 mL/min et le vaporisateur d’isoflurane entre 1,5 % et 2,5 % pour l’induction de l’anesthésie. Le temps passé dans la chambre avant la sédation complète est variable, bien qu’il varie généralement de 3 à 6 minutes. Enregistrez le poids du rat sous sédation et effectuez un test de pincement des orteils. Si des secousses ou des mouvements sont observés en réponse au pincement, replacez le rat à l’intérieur de la chambre d’induction pendant 1 minute supplémentaire et répétez le test de pincement des orteils. Répétez l’opération autant de fois que nécessaire pour vous assurer que le rat est et reste complètement anesthésié. Placez un coussin chauffant et un tampon absorbant stérile sur la plaque de fixation. Placez le rat sur le tampon absorbant, appliquez une pommade pour les yeux et placez un thermomètre rectal pour surveiller la température corporelle.REMARQUE : Pendant la durée de l’intervention chirurgicale, la température et la fréquence cardiaque du rat doivent être surveillées (idéalement, la fréquence cardiaque doit être comprise entre 330 et 480 bpm et la température entre 35,9 et 37,5 °C)18,19. Ajustez l’isoflurane ou le coussin chauffant en conséquence pour éviter une mort prématurée. Le coussin chauffant peut être réglé à une température d’environ 37 °C et doit être allumé et éteint au besoin pour maintenir la température corporelle optimale. Palpez la dernière côte du rat, qui est attachée à la colonne vertébrale au niveau de la13e vertèbre thoracique (T13). Utilisez un rasoir électrique pour raser la fourrure de la surface dorsale entre la dernière côte et le cou. Essuyez la peau exposée avec de la gaze imbibée d’iodopovidone à 10 %. Créez une incision médiane à l’aide de ciseaux à iris et disséquez à travers le fascia jusqu’à ce que les apophyses épineuses et le limbe soient exposés. Retirez l’os à l’aide d’une pince à os décalée et d’un ciseau à iris à lame coudée jusqu’à ce que la moelle épinière soit exposée20. La durée de la laminectomie et de l’incision varie en fonction du nombre de cibles différentes à soniser. Dans cette étude, une laminectomie à trois niveaux a été réalisée à l’aide d’une incision de 3 cm.REMARQUE : Évitez de toucher ou d’exercer une pression sur la moelle épinière lors de l’enlèvement de l’os pour éviter les blessures. Si les membres postérieurs du rat sont secoués pendant la laminectomie, cela signifie que trop de force a été exercée sur la moelle ou les racines nerveuses. Fixez le rat à la plaque de fixation en serrant les apophyses épineuses adjacentes à la laminectomie. Tirez légèrement sur la colonne vertébrale pour minimiser la courbure avant de verrouiller les pinces. 3. Localisation de la cible à l’aide d’un guidage laser Ajustez la position du transducteur à l’aide du bras stéréotaxique jusqu’à ce qu’il soit situé exactement au-dessus de la laminectomie (Figure 3A). Le cadre permet un mouvement sur les axes x, y et z, ainsi qu’une rotation de 180° dans le plan vertical et une rotation de 360° dans le plan horizontal. Fixez l’appareil laser au fond du cône d’eau et abaissez-le jusqu’à ce que le point laser soit visible. Ajustez la position latérale du transducteur jusqu’à ce que le point laser se trouve au-dessus de l’emplacement qui est la cible de la perturbation BSCB (Figure 3B,C).REMARQUE : Un fichier de conception assistée par ordinateur (CAO) pour l’appareil laser est inclus dans la section supplémentaire (Figure supplémentaire 1). Retirez l’appareil laser et remplissez l’espace entre le cône et la moelle épinière avec du gel à ultrasons dégazé (Figure 3D). Pour un couplage maximal, assurez-vous qu’aucune bulle d’air n’est présente dans le gel.REMARQUE : Dans cette étude, le transducteur avec un cône d’eau fixé a été abaissé jusqu’à ce qu’il soit situé à 1 cm au-dessus du cordon. Comme le cône d’eau mesurait 30 mm de long, la distance totale entre le transducteur et le cordon était de 40 mm. Le cône d’eau a été placé à 1 cm de la moelle épinière parce que la peau, le fascia et la musculature du rat de chaque côté de l’incision empêchent le contact direct entre l’extrémité du cône et le cordon. L’utilisation des chiffres sur l’axe des ordonnées du bras stéréotaxique peut être utile pour suivre la distance verticale à laquelle le cône est à 1 cm de la corde, d’autant plus que le gel rendra difficile la confirmation visuelle de la distance du cône par rapport à la corde. Réglez les paramètres de sonication sur le TPO. Une plage de valeurs peut être utilisée pour réussir la perturbation de la BSCB. Pour une puissance maximale, réglez la fréquence de sonication près de la fréquence centrale du transducteur. Les valeurs utilisées dans cette étude sont énumérées dans le tableau 1.NOTE : Les paramètres énumérés ici ont été adaptés à partir de travaux antérieurs avec le LIFU, avec une fréquence centrale de 500 kHz, une durée de rafale sonore de 500 μs, un facteur de marche de 50 % et des temps de sonication de 5 ou 10 min pour neuromoduler en toute sécurité la moelle épinière d’un rongeur21. Sur la base d’études qui ont réussi à obtenir une perturbation BSCB, d’autres paramètres peuvent être utilisés sont des fréquences centrales comprises entre 500 kHz et 1 MHz, des pressions de 0,2 à 2,1 MPa, des durées de rafale de 10 à 25 ms et des temps de sonication de 2 à 5 min 6,10,11,22. Paramètre Valeur Fréquence (kHz) 250 Distance de mise au point (mm) 40 Pression de crête acoustique (MPa) 0.47 Cycle d’utilisation 40% Longueur de la rafale (ms) 400 Période(s) 1 Temps de sonication (min) 5 Tableau 1 : Paramètres de sonication utilisés pour la perturbation BSCB. 4. Administration de microbulles Préparez une solution MB conformément aux instructions fournies par le fabricant. Évitez d’introduire de l’air dans la solution.REMARQUE : Les MB sont fragiles et s’agglutinent près du haut du flacon ou de la seringue s’ils sont laissés immobiles pendant quelques minutes. Agiter régulièrement le flacon et la seringue pour éviter une dispersion inégale des MB. Les MB ont une courte durée de vie ; Consultez le guide du fabricant pour déterminer le délai d’expiration. Insérez un cathéter de la veine caudale de 22 G et rincez avec 0,2 mL de solution saline héparinée (500 UI/mL)23. Pour augmenter les chances de réussite du cathétérisme de la veine caudale, trempez la queue dans de l’eau tiède et placez un garrot à la base de la queue pour agrandir le diamètre de la veine.REMARQUE : Le cathétérisme de la veine caudale peut être effectué avant la laminectomie animale, le positionnement et le ciblage pour gagner du temps à l’étude. Injecter 1 mL/kg d’EBD à 3 % dans le cathéter. Rincer avec 0,2 mL de solution saline héparinisée. Les extrémités et les yeux du rat deviendront bleus. Confirmez la réussite du cathétérisme de la veine caudale en vérifiant s’il y a un changement de couleur bleue dans la veine vertébrale dorsale du rat (Figure 4).REMARQUE : L’EBD peut être injecté bien avant l’injection de MB et n’influencera pas la sonication. De plus, étant donné que la Food and Drug Administration (FDA) n’a actuellement pas approuvé la sonication avec des médicaments déjà dans le système, l’EBD peut également être administré après la sonication. Cela se traduira par une absorption moindre du colorant, mais peut être plus pertinent sur le plan clinique. Injecter un bolus de 0,2 mL de MBs dans le cathéter et rincer avec 0,2 mL de solution saline héparinisée. Démarrer la sonication 1 à 2 min après l’injection de MB. La configuration utilisée ici ne recueille pas de retour de sonication en temps réel.REMARQUE : Les études sur la perturbation de la BSCB utilisent généralement une concentration plus élevée de MB que celle indiquée pour l’imagerie diagnostique. Certaines concentrations de marques MB courantes utilisées pour la perturbation de la BHE et de la BSCB dans les modèles de rats comprennent 0,02-0,2 mL/kg et des bolus de 200 μL 10,15,24,25. 5. Extraction de la moelle épinière et traitement des tissus Une fois la sonication terminée, perfuser le rat par voie transcardique avec 100 ml de solution saline tamponnée au phosphate froid (PBS) jusqu’à ce que le sang soit complètement clair. Le foie, qui est d’une riche couleur bleue en raison du colorant, devrait s’estomper en un bleu brunâtre clair26.REMARQUE : Le but de la perfusion est d’éliminer l’excès de sang du système vasculaire de la moelle épinière. Étant donné que l’EBD se lie à l’albumine, cela élimine également l’excès d’EBD. Cela permet de s’assurer que tout EBD détecté visuellement ou par microscopie à fluorescence dans la moelle épinière provient de l’extravasation du colorant dans le parenchyme rachidien. Perfuser par voie transcardique avec 100 mL de paraformaldéhyde (PFA) froid à 4 %. Les membres du rat se contracteront pendant cette fixation si elle est bien faite. Cette perfusion avec PFA euthanasie le rat. Retirez la moelle épinière et placez-la dans du PFA à 4 % à 4 °C pendant la nuit. Remplacez le PFA par du PBS le lendemain. 6. Visualisation de la perturbation de la BSCB Isolez une section de 2 cm entourant l’emplacement de la sonication à l’aide d’une lame de rasoir. Divisez la section le long de la ligne médiane avec la lame et la section en sections de 10 μm d’épaisseur à l’aide d’un microtome. Pour la visualisation en fond clair, colorez avec une coloration à l’hématoxyline-éosine (H&E).REMARQUE : Les échantillons de moelle épinière H&E montrés dans cette étude ont été colorés avec de l’hématoxyline pendant 3 min et de l’éosine pendant 1 min27. Pour la microscopie à fluorescence, déparaffiner les lames contenant les sections de moelle épinière et contre-colorer avec 25 μL de 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) dissous dans le milieu d’enrobage (0,5 μg/mL). Incuber à 4 °C pendant au moins 10 min. Évitez la lumière pour éviter le blanchiment.REMARQUE : La déparaffinisation peut être remplacée par l’utilisation d’un cryostat pour obtenir des sections congelées. Utilisez un microscope fluorescent pour imager toutes les lames. L’autofluorescence EBD (excitation : 470 nm et 540 nm ; émission : 680 nm) est visible dans le canal rouge, tandis que le DAPI est présent dans le canal bleu. Utilisez un microscope optique pour imager les lames H&E.REMARQUE : Bien que ce protocole décrive une procédure de non-survie, elle a également été réalisée à l’aide de techniques chirurgicales de survie. Pour la chirurgie de survie, désinfecter la peau avant l’incision avec 3 applications alternées d’iodopovidone et administrer de la buprénorphine par voie sous-cutanée (0,05 mg / kg) avant la chirurgie. Continuer à administrer de la buprénorphine sous-cutanée toutes les 12 h au moins 3 jours après l’opération, avec des jours supplémentaires si le rat présente des signes de douleur. En cas de lésion de la moelle épinière, les rats peuvent présenter une rétention urinaire ou une démarche anormale. Cela se traduira par une traînée ou un mouvement retardé des membres postérieurs ou des vessies palpables et distendues. Si cela se produit, les rats domestiques avec du gel d’eau enrichi en nutriments pour la nourriture et l’hydratation et expriment manuellement leur vessie deux fois par jour jusqu’à ce que la miction réflexe soit rétablie. S’il y a une paralysie complète des membres postérieurs ou une douleur réfractaire, euthanasiez le rat.

Representative Results

Cet article démontre que l’application concomitante de la sonication LIFU et de l’administration de MB est une technique efficace pour la perturbation localisée de la BSCB. L’ouverture du BSCB est indiquée par la présence d’une extravasation de l’EBD dans le parenchyme spinal. Les changements sont apparents à la fois visuellement et en microscopie à fluorescence. La vascularisation de la moelle épinière est visible après laminectomie et montre la veine spinale postérieure avec plusieurs petits vaisseaux rayonnant latéralement (Figure 4A). L’injection intraveineuse d’EBD par le cathéter de la veine caudale permet d’enrichir ce système vasculaire en colorant bleu (Figure 4B). C’est un bon point dans la procédure pour vérifier que la laminectomie n’a pas entraîné la rupture d’un système vasculaire rachidien, car cela entraînerait une accumulation de sang bleu sur le cordon. Après la sonication, une tache bleue devrait devenir visible au-dessus de l’emplacement ciblé, indiquant l’extravasation de l’EBD dans le parenchyme blanc en raison de la perturbation de la BSCB (Figure 4C). La taille de cette tache varie en fonction d’un certain nombre de facteurs, notamment la taille de la région focale du transducteur et le temps écoulé après la sonication. Pour augmenter les chances de voir une extravasation de l’EBD, il faut allonger le temps entre la sonication et l’extraction de la moelle épinière. Bien que la perfusion de PFA ne soit pas une étape nécessaire à effectuer avant l’extraction du cordon et l’analyse tissulaire ultérieure, elle élimine le sang de l’échantillon et augmente le contraste entre le parenchyme spinal blanc et les régions bleues colorées par l’EBD. Tous les rats qui ont reçu l’administration de MB et la sonication LIFU présentent une extravasation apparente de l’EBD dans la moelle épinière, tandis que les témoins négatifs qui ont reçu des MB et EBD sans sonication LIFU ne le font pas. Des images représentatives sont présentées à la figure 5. Les coupes sagittales à travers les tissus révèlent que l’extravasation de l’EBD n’est pas seulement superficielle, mais s’étend bien dans le cordon lui-même. C’est normal, car la région focale du transducteur utilisé dans cette étude est supérieure au diamètre de la moelle épinière du rat. Parfois, de petites quantités d’hémorragie peuvent être observées dans les coupures sagittales. Cela peut être dû à la laminectomie ou à l’échographie. Si l’hémorragie est proche de la périphérie dorsale du cordon, elle est plus probablement due à la laminectomie. Afin d’évaluer plus en détail l’extravasation de l’EBD, des coupes de moelle épinière sagittale ont été colorées avec du DAPI (marqueur nucléaire) et imagées à l’aide d’un microscope à fluorescence. Tous les cordons qui ont reçu une sonication LIFU (n = 3) ont montré une intensité significativement plus élevée d’autofluorescence EBD (p = 0,016) que les cordons qui n’ont pas reçu de sonication, avec des intensités similaires de DAPI présentes dans les deux (Figure 6). L’analyse H&E n’a en outre révélé aucune lésion neuronale, hémorragie ou lésion de cavité présente dans les emplacements sonisés, ce qui renforce l’innocuité de cette procédure. Des exemples de cordes blessées dues à une mauvaise manipulation chirurgicale et à une sonication de haute puissance sont présentés à titre de comparaison. Les hémorragies, les lésions tissulaires, les lésions de la cavité et une éventuelle vacuolisation sont étiquetées. Bien que l’exemple de sonication à haute puissance ne montre pas d’hémorragie, celle-ci a également été rapportée comme un effet de la perturbation par ultrasons. De plus, une analyse comportementale a été menée sur des rats qui ont reçu des sonications MBs, EBD et LIFU. Bien que cette méthode n’exclue pas complètement les lésions tissulaires, elle teste si des déficits moteurs sont survenus en raison de cette procédure. Les rats ont été enregistrés marchant dans une cage pendant 5 minutes chaque jour sur une période de 5 jours, et la fonction locomotrice a été classée sur la base de l’échelle locomotrice de Basso Beattie Bresnahan (fichier vidéo supplémentaire 1). Tous les rats (n = 5) ont reçu la note la plus élevée avant la sonication, après la sonication et tous les jours de la période de survie (figure 7). Enfin, les effets thermiques des paramètres de sonication utilisés dans cette étude ont été mesurés à l’aide de deux échantillons ex vivo de moelle épinière de rat et d’une sonde de thermomètre numérique avec une pointe fine insérée dans le cordon.  La température des échantillons de moelle épinière a été suivie pendant 5 minutes avant, pendant et après la sonication, pour un total de 15 minutes. Des changements minimes de température ont été observés. En fait, il y a eu un changement de ≤1,3 °C dû à la sonication dans les deux échantillons, ce qui a diminué la probabilité de lésions hyperthermiques à la suite de la sonication (figure 8). Figure 1 : Mécanisme d’ouverture de la barrière hémato-moelle épinière médiée par ultrasons focalisés de faible intensité. (A) Vue d’ensemble schématique de la sonication de la moelle épinière de rat par ultrasons focalisés de faible intensité (LIFU). (B) Le mécanisme d’ouverture de la barrière hémato-moelle épinière (BSCB) via la sonication LIFU de microbulles intraveineuses (MBs). Les MB oscillent en réponse au LIFU, provoquant l’élargissement des jonctions serrées entre les cellules endothéliales. Cette perturbation de la BSCB permet l’extravasation de nanoparticules, de médicaments thérapeutiques ou de colorant bleu d’Evans. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 2 : Configuration et connectivité de paillasse à ultrasons focalisés de faible intensité. (A) Représentation schématique montrant des composants typiques des ultrasons focalisés. (B) Vue d’ensemble de la configuration des ultrasons focalisés, y compris : 1. puissance de sortie du transducteur (TPO), 2. réseau d’appariement, 3. Transducteur LIFU, 4. l’instrument stéréotaxique, 5. Pinces mobiles. (C) Transducteur, y compris : 1. porte-sonde, 2. transducteur annulaire, 3. cône d’eau, 4. tube d’entrée d’eau, 5. tube de sortie d’eau, 6. membrane fixée par un élastique. (D) Façade du TPO, y compris : 1. boîtier blindé RF, 2. panneau d’affichage frontal tactile avec menu réglable, 3. bouton rotatif pour le réglage des paramètres, 4. interrupteur de sortie marche/arrêt. (E) Arrière du TPO, y compris : 1. connecteurs de sortie de canal, 2. mise à la terre, 3. port d’entrée USB pour le contrôle du logiciel, 4. déclencheur interne, 5. connecteur de sortie de synchronisation, 6. prise d’entrée d’alimentation et d’alimentation, 7. interrupteur marche/arrêt. (F) Sortie réseau correspondante, avec des fils correspondant aux numéros de canal. (G) Entrée XDR réseau correspondante, avec des fils correspondant aux numéros de canal Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 3 : Localisation de la cible à l’aide d’un guidage laser. (A) Bras stéréotaxique avec amplitude de mouvement dans les trois axes et capacités de rotation. Il est apposé sur la plaque de fixation ci-dessous. (B) Appareil laser pour l’identification de la zone focale. Le laser est positionné sur la pointe du transducteur et est aligné avec la région focale. (C) Illustration montrant le laser sur la moelle épinière exposée, indiquant que la région focale du transducteur est maintenant dirigée vers cet endroit. (D) Le transducteur est abaissé jusqu’à ce que l’extrémité du cône soit située à 1 cm au-dessus du cordon, et l’espace est rempli de gel pour assurer un couplage maximal. La distance entre le transducteur et la moelle épinière est de 40 mm (distance focale). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 4 : Extravasation du colorant bleu Evans dans la moelle épinière après la sonication. (A) Image de l’incision de laminectomie du rat T9-T11, avec la moelle épinière exposée et la veine dorsale postérieure clairement visibles. (B) Les tissus environnants et le système vasculaire de la moelle épinière deviennent bleus après injection intraveineuse de colorant bleu Evans (EBD). (C) Extravasation de l’EBD dans le parenchyme de la moelle épinière au site de la sonication, indiquant qu’une perturbation de la BSCB s’est produite. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 5 : Extraction de la moelle épinière et visualisation de l’ouverture du BSCB après la perfusion. (A) Moelle épinière excisée d’un rat témoin sans traitement LIFU. Ce rat n’a reçu que des MB et des EBD. La tranche médio-sagittale de la moelle noyée dans la paraffine est représentée dans l’encadré, et aucune extravasation EBD n’est visible. (B) Moelle épinière excisée d’un rat avec traitement LIFU. Ce rat a également reçu des MB et des EBD. La colonne d’extravasation EBD est visible et localisée dans la région sonique. La tranche mi-sagittale de la moelle noyée dans la paraffine est représentée dans l’encadré, avec une flèche pointant vers la concentration d’EBD visible à l’intérieur de l’emplacement sonique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 6 : Détection et évaluation de l’ouverture du BSCB. (A) Moelle épinière colorée au DAPI (marqueur nucléaire, bleu). Une autofluorescence EBD minimale (rouge) est visible. Ce rat n’a pas reçu de LIFU. (B) Moelle épinière colorée au DAPI (marqueur nucléaire, bleu). L’autofluorescence EBD localisée (en rouge) à l’emplacement de la cible sonique est visible. Ce rat a reçu du LIFU et des MBs. (C) La moelle épinière d’un rat sans LIFU colorée à l’hématoxyline (coloration des acides nucléiques) et à l’éosine (coloration protéique non spécifique) (H&E). Aucune lésion neuronale, hémorragie ou lésion de la cavité n’est visible. (D) La moelle épinière d’un rat atteint de LIFU colorée avec H&E. Aucune lésion neuronale, hémorragie ou cavité n’est visible. (E) Moelle épinière d’un rat présentant une lésion chirurgicale tachée de H&E. Les flèches indiquent une hémorragie abondante et des lésions tissulaires. (F) La moelle épinière d’un rat avec des dommages dus à une sonication de haute puissance colorée avec H&E. Les flèches indiquent des lésions de cavité, et l’encart montre une vacuolisation possible. (G) Graphiques à barres montrant l’intensité du DAPI et de l’EBD dans la moelle épinière de rats avec et sans sonication LIFU. Il y a significativement plus d’intensité EBD dans la moelle épinière LIFU par rapport au témoin négatif (p = 0,016), malgré une intensité DAPI similaire (p > 0,05). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 7 : Test comportemental avant et après la sonication. (A) Installation de l’appareil Basso, Beattie, Bresnahan, dans laquelle des rats ont été enregistrés marchant pendant 5 minutes à partir d’en bas. (B) Image fixe à partir d’une vidéo enregistrée. Cette vidéo a été utilisée pour évaluer la coordination motrice et la démarche du rat sur l’échelle de Basso, Beattie, Bresnahan. (C) Boîte à moustaches (n = 5) ne montrant aucun changement dans les scores moteurs avant la sonication, après la sonication ou pendant une période de survie de 5 jours chez les rats qui ont reçu des MB et un traitement LIFU (p > 0,05). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 8 : Analyse de la température à l’aide de moelle épinière ex vivo. Graphique illustrant les changements de température dans deux échantillons de moelle épinière ex vivo pendant une durée de 5 minutes avant, pendant et après la sonication. Les paramètres utilisés pour la sonication sont énumérés dans le tableau 1. Pour l’échantillon 1, les températures moyennes avant, pendant et après la sonication étaient respectivement de 21,9 °C ± 0,1 °C, de 22,1 °C ± 0,1 °C et de 22,0 °C ± 0,1 °C. Pour l’échantillon 2, les températures avant, pendant et après la sonication étaient respectivement de 21,9 °C ± 0,1 °C, de 22,5 °C ± 0,3 °C et de 22,4 °C ± 0,2 °C. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure supplémentaire 1 : Fichier CAO d’un appareil de ciblage laser. (A) Vue de l’appareil laser vue d’en bas. N’importe quel laser peut être placé dans le trou central au milieu. (B) Vue latérale de l’appareil laser. (C) Dimensions de l’appareil laser, avec des unités en pouces. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier. Fichier vidéo supplémentaire 1 : Vidéo d’un rat marchant dans l’appareil Basso, Beattie, Bresnahan. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Ici, l’équipement et les étapes nécessaires pour une perturbation efficace et ciblée de la BSCB à l’aide d’ultrasons focalisés de faible intensité (LIFU) combinés à l’administration de microbulles (MB) sont décrits. Ce protocole est flexible et peut être optimisé pour une utilisation individuelle avec des transducteurs de spécifications variables. D’autres techniques de perturbation de la BSCB médiée par LIFU reposent sur l’utilisation de systèmes guidés par imagerie par résonance magnétique (IRM) pour la localisation de la cible, qui est une ressource coûteuse16. Les avantages de la technique présentée ici résident dans la confirmation visuelle rapide et en temps réel de la perturbation de la BSCB et la facilité de ciblage due à la nature ouverte de la procédure. De plus, l’appareil laser est simple à utiliser et à construire, et un fichier CAO est inclus dans la section supplémentaire. Par conséquent, les chercheurs intéressés à effectuer des tests initiaux sur les capacités de ciblage de leur transducteur LIFU dans un modèle animal de petite taille peuvent utiliser ce protocole comme un outil pour confirmer rapidement le positionnement de la zone focale sur un emplacement d’intérêt. Cette technique peut également être utilisée par les laboratoires qui commencent à étudier les applications cliniques du LIFU, telles que l’administration de médicaments, avant d’investir dans des modalités de guidage plus complexes telles que les systèmes d’échographie ou d’IRM. À l’heure actuelle, les modalités guidées par les États-Unis présentent une voie plus prometteuse et plus rentable que les systèmes d’IRM, bien que ces derniers soient plus fréquemment observés dans la littérature.

Il y a plusieurs étapes critiques dans cette procédure qui doivent être exécutées avec soin pour assurer une perturbation réussie de la BSCB. Il est impératif d’éviter d’exercer une pression inutile sur la moelle épinière lors de la laminectomie chirurgicale. Une trop grande manipulation physique du cordon augmente la probabilité d’endommager le BSCB. Les dommages apparaissent sous la forme d’une tache brun foncé à l’intérieur du cordon après l’extraction en raison d’une hémorragie et d’une extravasation accrue de l’EBD. De plus, un couplage maximal doit être assuré entre le transducteur et la moelle épinière exposée. Par conséquent, il faut veiller à éliminer les bulles du cône d’eau et du gel à ultrasons. Il ne doit pas y avoir d’espace entre le fond du cône d’eau et le cordon pour assurer une transmission complète de l’onde acoustique. Pendant le cathétérisme de la veine caudale, il faut éviter de faire passer accidentellement de l’air avec les solutions salines héparinisées, EBD ou MB. L’injection d’air augmente considérablement le risque d’embolie pulmonaire qui entraîne la mort des rongeurs avant la fin de la procédure28.

Un problème courant qui peut être rencontré au cours de cette procédure est l’échec de l’injection réussie d’EBD. Pour les personnes ayant une expérience minimale du cathétérisme des veines caudales, la réalisation de cette étape avant la laminectomie, le positionnement ou le ciblage de l’animal permettra de gagner du temps. L’EBD peut également être injecté bien avant l’injection de MB sans influencer la sonication. L’utilisation du garrot et du bain d’eau chaude suggérés dans ce protocole aidera à dilater les veines de la queue et à augmenter le taux de réussite. De plus, la déshydratation chez le rat réduit la probabilité d’une mise en place correcte du cathéter. Une injection intrapéritonéale de solution saline 10 à 15 minutes avant le cathétérisme de la veine caudale peut aider. Pendant le cathétérisme, il faut commencer à 2 au-dessus de l’extrémité de la queue et se déplacer dans une direction caudale à crânienne. Aller dans la direction opposée diminue la probabilité de succès en raison d’un collapsus veineux ou d’une hémorragie potentielle.

Un autre défi courant concerne l’absence d’extravasation de l’EBD malgré la sonication. Cela peut indiquer que les paramètres utilisés pour la sonication sont insuffisants pour la perturbation de la BSCB. Par exemple, si la fréquence de sonication est réglée à une valeur qui diffère considérablement de la fréquence centrale du transducteur, la puissance de sonication sera trop faible pour faire osciller les MB et provoquer un desserrage serré de la jonction. De plus, plus il y a d’interfaces entre le transducteur et le cordon (par exemple, cône d’eau, membrane, gel, bulles d’air dans l’eau/le gel), plus l’intensité réelle de la sonication sera faible à la cible. La minimisation de ces interfaces, par exemple en utilisant du gel dégazé et en éliminant complètement les bulles à l’intérieur du cône, aidera à transmettre tout le potentiel de la sonication. Le protocole encourage également l’augmentation du temps entre la sonication et la perfusion afin de laisser plus de temps pour l’extravasation de l’EBD dans le parenchyme spinal. Bien que la perturbation de la BSCB soit une procédure transitoire, les lacunes sont présentes pendant plusieurs heures avant de se fermer. Un long temps d’attente augmente l’exposition à l’isoflurane, mais entraîne également une plus grande extravasation de l’EBD dans le cordon. Alternativement, une extravasation EBD peut être présente malgré l’absence de sonication avec LIFU. Pour résoudre ce problème, des précautions doivent être prises pendant la laminectomie pour éviter tout dommage accidentel au BSCB. Les solutions potentielles comprennent le soulèvement de la colonne vertébrale du rat pendant le serrage pour augmenter l’espace entre les lames et le cordon, ainsi qu’une laminectomie plus courte. Une perfusion complète de PFA réduit également la coloration de fond en éliminant le sang enrichi en EBD du système vasculaire de la moelle épinière. Lors de la perfusion transcardique, des précautions doivent être prises pour éviter une rupture accidentelle du cœur, qui peut entraîner une fuite de PBS ou de PFA.

Il est important de noter que cette étude représente une expérience monocentrique pour la perturbation de la BSCB médiée par le LIFU. De plus, ce protocole ne teste ni n’optimise divers paramètres d’énergie de sonication et concentrations de MB. Par conséquent, les chercheurs sont encouragés à étudier divers paramètres et concentrations lors de l’exécution de cette technique afin d’optimiser la localisation de la cible et la perturbation de la BSCB pour leurs besoins de recherche particuliers, en particulier si les résultats initiaux produisent des effets indésirables. Les groupes qui souhaitent ne voir aucun changement de température, par exemple, peuvent tester divers paramètres jusqu’à ce qu’ils trouvent un ensemble qui répond à ce critère et qui obtienne une perturbation suffisante de la BSCB. De plus, des expériences supplémentaires peuvent être menées pour confirmer l’innocuité de cette technique. Par exemple, la taille des échantillons peut être augmentée, la période de survie peut être prolongée et des études d’électromyographie/analyse de la marche peuvent être menées. Pour les survies plus longues, il est important de garder à l’esprit que certaines études montrent que des doses élevées d’EBD peuvent parfois provoquer une toxicité systémique chronique, de sorte qu’une dose plus faible peut être prudente29.

Une autre limite de cette procédure est la nature invasive de la laminectomie (qui est nécessaire pour toute technique qui utilise le LIFU pour l’ouverture du BSCB puisque les ultrasons ne peuvent pas pénétrer à travers l’os). Le caractère invasif de cette procédure peut être réduit en limitant la durée de la laminectomie. La réalisation de la laminectomie dans les vertèbres thoraciques supérieures, qui sont plus courtes et plus fines, peut réduire le temps nécessaire à la laminectomie à moins de 10 minutes. En raison de la nature fragile des MB, ainsi que de leur courte demi-vie, le temps est limité au cours de ce protocole. L’injection de MB doit avoir lieu 1 à 2 minutes avant le traitement par LIFU, et de nouveaux MB doivent être administrés avant chaque sonication si plusieurs traitements LIFU sont effectués. Dans le cas d’expériences impliquant une perturbation de la BSCB chez plusieurs rats, il peut être nécessaire de préparer plusieurs flacons de MB. Comme les microbulles sont coûteuses, il est préférable de modifier le flux de travail chirurgical pour minimiser le temps entre les sonications afin de conserver le nombre de Mo utilisés.

La technique décrite ici est principalement destinée à être utilisée comme protocole de recherche. Bien que l’appareil de ciblage laser ne remplace pas les modalités de ciblage traditionnelles dans tous les contextes cliniques, il peut être utile dans d’autres situations. Pour les chirurgies non invasives, les modalités traditionnelles d’IRM peuvent être utilisées de manière fiable pour cibler30. Pour les chirurgies invasives qui comprennent une laminectomie, l’appareil à point laser décrit dans ce protocole peut être utilisé pour localiser rapidement le centre de la zone focale de sonication sur une région spécifique (par exemple, une tumeur ou un site de lésion de la moelle épinière) à des fins d’administration de médicament ou de traitement immunomodulateur tout en complétant tout guidage IRM qui aurait lieu.

Dans l’ensemble, ce protocole décrit une technique efficace et réussie pour la perturbation de la BSCB et comprend plusieurs options pour confirmer l’ouverture de la BSCB, à la fois en temps réel et en post-traitement. Le BSCB fonctionnant comme une barrière à l’entrée dans le parenchyme de la moelle épinière, la perturbation du BSCB est une méthode possible pour améliorer l’administration de traitements. Par exemple, Weber-Adrian et al. ont utilisé LIFU avec une fréquence de 1,114 MHz et une longueur de rafale de 10 ms pour médier la livraison de gènes à la colonne cervicale6. De même, Smith et al. ont montré que le LIFU avec une fréquence de 580 kHz, des pressions acoustiques de crête moyennes d’environ 0,46 MPa et une longueur de rafale de 10 ms pourrait aider à l’administration d’un anticorps monoclonal, le trastuzumab, à la moelle épinière dans un modèle de rongeurs de métastases leptoméningées10. La plupart des études se sont concentrées sur l’utilisation de LIFU, plutôt que HIFU, en raison de la capacité du LIFU à perméabiliser transitoirement le BSCB tout en évitant d’endommager les tissus sous-jacents. En règle générale, le LIFU utilise des intensités comprises entre 0,125 et 3 W/cm 2, tandis que le HIFU utilise des intensités comprises entre 100 et 10 000 W/cm2 ou plus31. En conséquence, HIFU exerce ses effets principalement par le chauffage des tissus, tandis que LIFU, avec l’administration concomitante de MB, agit par des effets de cavitation mécanique. L’administration concomitante de traitements avec des MB peut entraîner une plus grande extravasation du médicament dans le parenchyme spinal, ainsi que la possibilité de charger les MB avec du médicament et de lyser les MB avec des ultrasons pour une administration ciblée du médicament.

Les paramètres de sonication, la concentration en MB et le type de transducteur utilisés dans cette étude peuvent être modifiés en fonction des besoins expérimentaux. Par exemple, un transducteur avec une région focale plus petite peut être préférable pour les expériences dans lesquelles un plus grand contrôle est nécessaire sur le ciblage localisé, tandis qu’un transducteur avec une puissance plus élevée peut être utilisé pour les expériences qui nécessitent une perturbation puissante dans un laps de temps plus court. En raison de la flexibilité offerte par ce protocole, il existe un grand potentiel d’utilisation dans la recherche préclinique, clinique et translationnelle.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Avec le soutien de T32GM136577 (D.R.) ; N660012024075 (N.T., N.V.T., A.M., K.K.L.) ; R01 HL139158-01A1 et R01 HL071568-15 (N.V.T.) ; Programme de bourses de recherche clinique du TPIR de l’Université Johns Hopkins (KL2) (A.M). Plusieurs figurines créées avec BioRender.com.

Materials

0.9% Heparinized Sodium Chloride Baxter FKB0953G Flush tail vein catheter with heparinized saline to prevent clotting.
100 mL Luer Lock Tip Syringe (2) Wilburn Medical WUSA/120 One syringe can be used to inject PBS and one for PFA (during transcardial perfusion)
1x Phosphate buffered saline (PBS) Thermo Scientific  10010001 For transcardial perfusion.
22 G catheter Med Vet International 50-209-1694 Use to place a tail vein catheter.
97% Isoflurane Thermo Scientific Chemicals 247-897-7 While rat is under isoflurane, be careful not to administer too much. A high dose can euthanize the rat.
Betadine 7.5% Purdue Products 4677
Class A clear threaded glass vial Fisherbrand 14-955-314 Use to store spinal cord extraction.
Digital balance scale Kent Scientific SCL-4000
Electric razor Wahl Home Products 79449-200 Shave fur off skin at incision site before surgery
Eosin-Y with Phloxine Epredia 71304
Evans blue dye MP Biomedicals 02151108-CF Although it is non-toxic, it will stain skin blue if direct contact occurs.
Fixation Plate Assembly with 0.5 mm Forceps PSI Impactors 7001-2 Affix the stereotactic arm to this frame
Gauze Fisherbrand 13-761-52 
Heating pad  Kent Scientific RT-0515
Hematoxylin Epredia 7211
Iris Scissors with Angled Blades ProDentUSA 12-15315
Isoflurane induction system   Kent Scientific SOMNO-RATKIT
Laser targetting apparatus NA custom CAD design file provided in supplemental section. Simply place a laser inside the apparatus created from the file. 
Lubricating eye ointment Systane N/A
Luer Lock 3-Way Stopcock Sigma SAS7521-10EA Can use to fill water cone through inlet valve
Lumason microbubbles kit Bracco 0270-7099-16
Microscope cover glass Fisherbrand 12-545J
Microscope slides Fisherbrand 12-550-15 
Microtome Epredia 23-900-671 
Mounting medium with 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Vector Laboratories H-2000-2
Mylar membrane Chemplex 3016 Can cut membrane to appropriate size if too large for cone
NeuroFUS 2.52" diameter 250 kHz transducer Sonic Concepts CTX-250 Transducer system includes custom water cone and probe holder
NeuroFUS PRO v2.0 system Sonic Concepts NFS102v2 Includes Transducer Power Output, Matching Network and associated cables
Offset Bone Nippers Fine Science Tools 16101-10 Use to remove spinous processes and laminae for laminectomy
Paraffin Polysciences 24364-1  Can place spinal cord sample in paraffin to slice into thin sections for histology.
Paraformaldehyde (4%) Thermo Scientific  J61899-AK For transcardial perfusion.
Rat Surgical Kit Kent Scientific INSRATKIT Consists of tweezer #5, needle holder, McPherson-Vannas scissors, Iris scissors, ALM self-retaining retractors, Iris forceps, and blunt probe. These products should be sufficient to perform a laminectomy.
Razor blade Fisherbrand 12-640 Use to cut spinal cord extraction to desirable length and split section down midline.
Rectal thermometer Kent Scientific RET-2 Maintain rat temperature between 35.9–37.5 °C
Rubber band Fisherbrand 50-205-1983
Single animal vaporizer unit Kent Scientific SF-01
Stereotactic arm Kopf Instruments Model 963
Sterile absorbent pad McKesson 4033-CS150 Place under rat and above heating pad and fixation plate before laminectomy
Ultrasound gel Aquasonic PLI 01-34 Ensure gel is free of bubbles to the best of your ability.
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References

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Bhimreddy, M., Routkevitch, D., Hersh, A. M., Mohammadabadi, A., Menta, A. K., Jiang, K., Weber-Levine, C., Davidar, A. D., Punnoose, J., Kempski Leadingham, K. M., Doloff, J. C., Tyler, B., Theodore, N., Manbachi, A. Disruption of the Blood-Spinal Cord Barrier Using Low-Intensity Focused Ultrasound in a Rat Model. J. Vis. Exp. (193), e65113, doi:10.3791/65113 (2023).
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