Un protocollo per valutare e quantificare le patologie dell'epitelio pigmentato retinico in modelli murini di degenerazione maculare legata all'età

La degenerazione maculare legata all’età (AMD) è una malattia accecante comune che colpisce le popolazioni di età superiore ai 55^{anni 1}. Molti ricercatori ritengono che la disfunzione all’interno dell’epitelio pigmentato retinico (RPE) sia un evento patobiologico precoce e cruciale nell’AMD². L’RPE è un monostrato di cellule polarizzate che ha il compito di mantenere l’omeostasi dei fotorecettori vicini e dei vasi sanguigni coroideali³. Esistono vari modelli per studiare i meccanismi associati alla malattia all’interno dell’RPE, compresi i modelli di coltura cellulare ^4,5 e topi 6,7,8. Un recente rapporto ha descritto protocolli standardizzati e criteri di controllo della qualità per i modelli di coltura cellulare RPE⁴, ma nessun rapporto ha tentato di standardizzare la fenotipizzazione dell’RPE nei modelli murini. In effetti, molte pubblicazioni su modelli murini di AMD mancano di una descrizione completa dell’RPE o della quantificazione delle patologie RPE in essi. L’obiettivo generale di questo protocollo è quello di presentare metodi standard di fenotipizzazione RPE con valutazioni quantitative imparziali per gli scienziati che utilizzano modelli murini AMD.

Pubblicazioni precedenti hanno notato la presenza di diverse patologie RPE nei topi attraverso tre tecniche di imaging. Ad esempio, la microscopia ottica consente ai ricercatori di visualizzare la morfologia grossolana della retina murina (Figura 1A) e rilevare patologie RPE come assottigliamento RPE, vacuolizzazione e migrazione. L’assottigliamento dell’RPE in un modello di mouse AMD è esemplificato da una deviazione nell’altezza dell’RPE dai rispettivi controlli (Figura 1B). La vacuolizzazione RPE può essere suddivisa in due categorie separate: microvacuolizzazione (Figura 1C) e macrovacuolizzazione (Figura 1D). La microvacuolizzazione RPE è riassunta dalla presenza di vacuoli nell’RPE che non influiscono sulla sua altezza complessiva, mentre la macrovacuolizzazione è indicata dalla presenza di vacuoli che sporgono nei segmenti esterni dei fotorecettori. La migrazione RPE si distingue per l’aggregato focale di pigmento sopra il monostrato RPE in una sezione trasversale retinica (Figura 1E). Va notato che le cellule RPE migratorie negli occhi dei donatori di AMD mostrano immunoreattività ai marcatori delle cellule immunitarie, come il cluster di differenziazione 68 (CD68)9, e potrebbero rappresentare cellule immunitarie che inghiottono detriti RPE o RPE in fase di transdifferenziazione ⁹. Un’altra tecnica di imaging chiamata microscopia elettronica a trasmissione può consentire ai ricercatori di visualizzare l’ultrastruttura dell’RPE e la sua membrana basale (Figura 2A). Questa tecnica può identificare il deposito sub-RPE predominante nei topi, noto come deposito laminare basale (BLamD) (Figura 2B)¹⁰. Infine, la microscopia confocale può rivelare la struttura delle cellule RPE attraverso l’imaging di supporti piatti RPE (Figura 3A). Questo metodo può scoprire la dismorfia RPE, la deviazione dell’RPE dalla sua classica forma a nido d’ape (Figura 3B). Può anche rilevare la multinucleazione RPE, la presenza di tre o più nuclei all’interno di una cellula RPE (Figura 3C). Per una sintesi dei tipi di patologie RPE presenti negli attuali modelli murini AMD, rimandiamo i ricercatori a queste recensioni dalla letteratura ^6,7.

I ricercatori che studiano l’AMD dovrebbero essere consapevoli dei vantaggi e degli svantaggi dell’uso dei topi per studiare le patologie RPE prima del protocollo di fenotipizzazione. I topi sono vantaggiosi a causa della loro durata di vita relativamente breve e del rapporto costo-efficacia, nonché della loro manipolabilità genetica e farmacologica. I topi mostrano anche cambiamenti degenerativi RPE, tra cui migrazione RPE, dismorfia e multinucleazione, che si osservano negli occhi dei donatori di AMD 11,12,13,14,15,16,17; ciò suggerisce che meccanismi simili possono essere alla base dello sviluppo di queste patologie RPE nei topi e negli esseri umani. Tuttavia, ci sono differenze chiave che limitano la traducibilità degli studi sui topi all’AMD umana. In primo luogo, i topi non hanno una macula, una regione anatomicamente distinta della retina umana necessaria per l’acuità visiva che è preferenzialmente influenzata nell’AMD. In secondo luogo, alcune patologie RPE nei topi, come l’assottigliamento e la vacuolizzazione dell’RPE, non sono tipicamente osservate negli occhi dei donatori di AMD¹⁸. In terzo luogo, i topi non sviluppano drusen, un segno distintivo della patologia AMD¹⁹. Le drusen sono depositi contenenti lipidi e proteine con pochissime proteine di membrana basale che si formano tra la lamina basale RPE e lo strato collagenoso interno della membrana di Bruch (BrM)¹⁹. Drusen differisce da BLamD, il comune deposito sub-RPE nei topi, sia nella loro composizione che nella posizione anatomica. Le BLamD sono anomalie arricchite dalla matrice extracellulare dipendenti dall’età e dallo stress che si formano tra la lamina basale RPE di BrM e le pieghe basali dell’RPE²⁰. È interessante notare che i BLamD hanno una composizione proteica e un aspetto simili sia nei topi che negli esseri umani ^6,10,21. Lavori recenti suggeriscono che i BLamD possono agire nella patobiologia dell’AMD influenzando la progressione dell’AMD fino alle sue fasi successive^18,22; pertanto, questi depositi possono rappresentare RPE malato nella retina del topo. La conoscenza di questi benefici e limitazioni è fondamentale per i ricercatori interessati a tradurre i risultati degli studi sui topi in AMD.

In questo protocollo, discutiamo i metodi per preparare gli occhi alla luce, alla trasmissione elettronica e alla microscopia confocale per visualizzare le patologie RPE. Descriviamo anche come quantificare le patologie RPE in modo imparziale per i test statistici. Come prova del concetto, utilizziamo il protocollo di fenotipizzazione RPE per studiare le patologie strutturali RPE osservate nei topi sovraesprimenti della proteina transmembrana 135- (Tmem135) e nei topi C57BL / 6J wild-type (WT) invecchiati. In sintesi, ci proponiamo di descrivere la metodologia di fenotipizzazione per caratterizzare l’RPE nei modelli murini AMD, poiché attualmente non sono disponibili protocolli standard. I ricercatori interessati a esaminare e quantificare le patologie dei fotorecettori o della coroide, che sono anche interessati nei modelli murini AMD, potrebbero non trovare questo protocollo utile per i loro studi.