Protocolo para Avaliação e Quantificação de Patologias do Epitélio Pigmentado da Retina em Modelos Murinos de Degeneração Macular Relacionada à Idade

A degeneração macular relacionada à idade (DMRI) é uma doença cegante comum que afeta populações acima de 55 anos^1. Muitos pesquisadores acreditam que a disfunção dentro do epitélio pigmentado da retina (PSE) é um evento patobiológico precoce e crucial na DMRI². O EPR é uma monocamada de células polarizadas encarregada de manter a homeostase dos fotorreceptores vizinhos e dos vasos sanguíneos de coroide³. Existe uma variedade de modelos para investigar mecanismos associados à doença dentro do EPR, incluindo modelos de cultura de células^4,5 e camundongos 6,7,8. Um relatório recente descreveu protocolos padronizados e critérios de controle de qualidade para modelos de cultura de células PSE⁴, mas nenhum relato tentou padronizar a fenotipagem do EPR em modelos de camundongos. De fato, muitas publicações sobre modelos de camundongos com DMRI carecem de uma descrição completa do EPR ou quantificação das patologias do EPR neles. O objetivo geral deste protocolo é apresentar métodos padrão de fenotipagem de EPR com avaliações quantitativas imparciais para cientistas usando modelos de camundongos com DMRI.

Publicações anteriores observaram a presença de várias patologias do EPR em camundongos através de três técnicas de imagem. Por exemplo, a microscopia de luz permite aos pesquisadores visualizar a morfologia macroscópica da retina murina (Figura 1A) e detectar patologias do EPR, como afinamento do EPR, vacuolização e migração. O afinamento do EPR em um modelo de mouse AMD é exemplificado por um desvio na altura do EPR em relação aos seus respectivos controles (Figura 1B). A vacuolização do EPR pode ser dividida em duas categorias distintas: microvacuolização (Figura 1C) e macrovacuolização (Figura 1D). A microvacuolização do EPR é resumida pela presença de vacúolos no EPR que não afetam sua altura total, enquanto a macrovacuolização é indicada pela presença de vacúolos que se projetam para os segmentos externos dos fotorreceptores. A migração do EPR é distinguida pelo agregado focal de pigmento acima da monocamada do EPR em um corte transversal da retina (Figura 1E). Deve-se ressaltar que as células migratórias do EPR em olhos de doadores de DMRI exibem imunorreatividade a marcadores de células imunes, como o cluster de diferenciação 68 (CD68)⁹, e poderiam representar células imunes engolindo restos de EPR ou EPR em transdiferenciação9. Outra técnica de imagem chamada microscopia eletrônica de transmissão pode permitir ao pesquisador visualizar a ultraestrutura do EPR e sua membrana basal (Figura 2A). Essa técnica pode identificar o depósito sub-PSE predominante em camundongos, conhecido como depósito laminar basal (BLamD) (Figura 2B)¹⁰. Por fim, a microscopia confocal pode revelar a estrutura das células do EPR por meio de imagens de suportes planos do EPR (Figura 3A). Esse método pode revelar a dismorfia do EPR, o desvio do EPR de sua forma clássica em favo de mel (Figura 3B). Também pode detectar multinucleação do EPR, a presença de três ou mais núcleos dentro de uma célula do EPR (Figura 3C). Para um resumo dos tipos de patologias do EPR presentes nos modelos atuais de camundongos com DMRI, remetemos os pesquisadores para essas revisões da literatura ^6,7.

Os pesquisadores que estudam a DMRI devem estar cientes das vantagens e desvantagens do uso de camundongos para investigar patologias do EPR antes do protocolo de fenotipagem. Os camundongos são vantajosos por causa de sua vida útil relativamente curta e custo-efetividade, bem como sua manipulabilidade genética e farmacológica. Camundongos também exibem alterações degenerativas do EPR, incluindo migração do EPR, dismorfia e multinucleação, que são observadas em olhos de doadores de DMRI11,12,13,14,15,16,17; isso sugere que mecanismos semelhantes podem estar subjacentes ao desenvolvimento dessas patologias do EPR em camundongos e humanos. No entanto, existem diferenças fundamentais que limitam a traduzibilidade de estudos em camundongos para DMRI humana. Primeiro, os camundongos não têm mácula, uma região anatomicamente distinta da retina humana necessária para a acuidade visual que é preferencialmente afetada na DMRI. Em segundo lugar, algumas patologias do EPR em camundongos, como afinamento e vacuolização do EPR, não são tipicamente vistas em olhos de doadores de DMRI¹⁸. Terceiro, camundongos não desenvolvem drusa, uma característica da patologia da DMRI¹⁹. Drusen são depósitos contendo lipídios e proteínas com pouquíssimas proteínas da membrana basal que se formam entre a lâmina basal do EPR e a camada colágena interna da membrana de Bruch (BrM)¹⁹. Drusen diferem de BLamD, o depósito comum de sub-PSE em camundongos, tanto em sua composição quanto em sua localização anatômica. Os BLamDs são anormalidades enriquecidas com matriz extracelular dependentes da idade e do estresse que se formam entre a lâmina basal do EPR do BrM e os infoldings basais do EPR²⁰. Curiosamente, os BLamDs têm composição e aparência proteica semelhantes em camundongos e humanos ^6,10,21. Trabalhos recentes sugerem que os BLamDs podem atuar na patobiologia da DMRI, influenciando a progressão da DMRI para seus estágios mais avançados^18,22; portanto, esses depósitos podem representar EPR doente na retina de camundongos. O conhecimento desses benefícios e limitações é fundamental para pesquisadores interessados em traduzir resultados de estudos em camundongos para a DMRI.

Neste protocolo, discutimos os métodos de preparação dos olhos para luz, elétrons de transmissão e microscopia confocal para visualização de patologias do EPR. Também descrevemos como quantificar patologias do EPR de forma imparcial para testes estatísticos. Como prova de conceito, utilizamos o protocolo de fenotipagem do EPR para investigar as patologias estruturais do EPR observadas em camundongos superexpressando a proteína transmembrana 135- (Tmem135) e camundongos selvagens envelhecidos (WT) C57BL/6J. Em resumo, objetivamos descrever a metodologia de fenotipagem para caracterizar a PSE em modelos de camundongos com DMRI, uma vez que atualmente não existem protocolos padronizados disponíveis. Pesquisadores interessados em examinar e quantificar patologias dos fotorreceptores ou coroides, que também são afetadas em modelos de camundongos com DMRI, podem não achar esse protocolo útil para seus estudos.