Ein Protokoll zur Bewertung und Quantifizierung von retinalen pigmentierten Epithelpathologien in Mausmodellen der altersbedingten Makuladegeneration

Die altersbedingte Makuladegeneration (AMD) ist eine häufige Erblindungskrankheit, die Menschen über 55 Jahre betrifft¹. Viele Forscher glauben, dass eine Funktionsstörung innerhalb des retinalen pigmentierten Epithels (RPE) ein frühes und entscheidendes pathobiologisches Ereignis bei AMD² ist. Das RPE ist eine Monoschicht polarisierter Zellen, die die Aufgabe hat, die Homöostase benachbarter Photorezeptoren und Aderhautblutgefäße aufrechtzuerhalten³. Es gibt eine Vielzahl von Modellen, um krankheitsassoziierte Mechanismen innerhalb des RPE zu untersuchen, darunter die Zellkulturmodelle^4,5 und Mäuse ^6,7,8. In einem kürzlich veröffentlichten Bericht wurden standardisierte Protokolle und Qualitätskontrollkriterien für RPE-Zellkulturmodelle^{beschrieben 4}, jedoch wurde in keinem Bericht versucht, die Phänotypisierung des RPE in Mausmodellen zu standardisieren. Tatsächlich fehlt in vielen Veröffentlichungen zu Mausmodellen der AMD eine vollständige Beschreibung des RPE oder eine Quantifizierung der RPE-Pathologien in ihnen. Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, Standard-RPE-Phänotypisierungsmethoden mit unvoreingenommenen quantitativen Bewertungen für Wissenschaftler mit AMD-Mausmodellen zu präsentieren.

Frühere Veröffentlichungen haben das Vorhandensein mehrerer RPE-Pathologien bei Mäusen durch drei bildgebende Verfahren festgestellt. Die Lichtmikroskopie ermöglicht es Forschern beispielsweise, die grobe Morphologie der murinen Netzhaut zu betrachten (Abbildung 1A) und RPE-Pathologien wie RPE-Verdünnung, Vakuolisierung und Migration zu erkennen. Die RPE-Ausdünnung in einem AMD-Mausmodell wird durch eine Abweichung der RPE-Höhe von den jeweiligen Kontrollen veranschaulicht (Abbildung 1B). Die RPE-Vakuolisierung kann in zwei separate Kategorien unterteilt werden: Mikrovakuolisierung (Abbildung 1C) und Makrovakuolisierung (Abbildung 1D). Die RPE-Mikrovakuolisierung wird durch das Vorhandensein von Vakuolen im RPE zusammengefasst, die seine Gesamthöhe nicht beeinflussen, während die Makrovakuolisierung durch das Vorhandensein von Vakuolen angezeigt wird, die in die äußeren Segmente der Photorezeptoren hineinragen. Die RPE-Migration wird durch das fokale Pigmentaggregat oberhalb der RPE-Monoschicht in einem Netzhautquerschnitt unterschieden (Abbildung 1E). Es sollte beachtet werden, dass migrierende RPE-Zellen in AMD-Spenderaugen Immunreaktivität gegenüber Immunzellmarkern wie dem Cluster of Differentiation 68 (CD68)⁹ aufweisen und Immunzellen darstellen könnten, die RPE-Trümmer verschlingen, oder RPE, die sich einer^{Transdifferenzierung} unterziehen9. Ein weiteres bildgebendes Verfahren, die sogenannte Transmissionselektronenmikroskopie, kann es den Forschern ermöglichen, die Ultrastruktur des RPE und seiner Basalmembran sichtbar zu machen (Abbildung 2A). Mit dieser Technik kann die vorherrschende Sub-RPE-Ablagerung in Mäusen identifiziert werden, die als basale laminare Ablagerung (BLamD) bekannt ist (Abbildung 2B)¹⁰. Schließlich kann die konfokale Mikroskopie die Struktur von RPE-Zellen durch die Abbildung von RPE-Flachhalterungen aufdecken (Abbildung 3A). Mit dieser Methode kann die RPE-Dysmorphie, die Abweichung des RPE von seiner klassischen Wabenform (Abbildung 3B), aufgedeckt werden. Es kann auch die RPE-Mehrkernbildung erkennen, d. h. das Vorhandensein von drei oder mehr Kernen innerhalb einer RPE-Zelle (Abbildung 3C). Für eine Zusammenfassung der Arten von RPE-Pathologien, die in aktuellen AMD-Mausmodellen vorhanden sind, verweisen wir Forscher auf diese Übersichtsarbeiten aus der Literatur ^6,7.

Forscher, die AMD untersuchen, sollten sich der Vor- und Nachteile der Verwendung von Mäusen zur Untersuchung von RPE-Pathologien vor dem Phänotypisierungsprotokoll bewusst sein. Mäuse zeichnen sich durch ihre relativ kurze Lebensdauer und Kosteneffizienz sowie ihre genetische und pharmakologische Manipulierbarkeit aus. Mäuse weisen auch degenerative RPE-Veränderungen auf, einschließlich RPE-Migration, Dysmorphie und Mehrkernbildung, die in AMD-Spenderaugen beobachtet werden 11,12,13,14,15,16,17; Dies deutet darauf hin, dass ähnliche Mechanismen der Entwicklung dieser RPE-Pathologien bei Mäusen und Menschen zugrunde liegen könnten. Es gibt jedoch wesentliche Unterschiede, die die Übertragbarkeit von Mausstudien auf die menschliche AMD einschränken. Erstens haben Mäuse keine Makula, eine anatomisch unterschiedliche Region der menschlichen Netzhaut, die für die Sehschärfe notwendig ist und bei AMD bevorzugt betroffen ist. Zweitens werden einige RPE-Pathologien bei Mäusen, wie z. B. RPE-Verdünnung und Vakuolisierung, typischerweise nicht in AMD-Spenderaugen beobachtet¹⁸. Drittens entwickeln Mäuse keine Drusen, ein Kennzeichen der AMD-Pathologie¹⁹. Drusen sind lipid- und proteinhaltige Ablagerungen mit sehr wenigen Basalmembranproteinen, die sich zwischen der RPE-Basallamina und der inneren kollagenen Schicht der Bruchschen Membran (BrM) ^bilden19. Drusen unterscheiden sich sowohl in ihrer Zusammensetzung als auch in ihrer anatomischen Lage von BLamD, der häufigen Sub-RPE-Ablagerung in Mäusen. BLamDs sind alters- und stressabhängige extrazelluläre Matrix-angereicherte Anomalien, die sich zwischen der RPE-Basallamina von BrM und den basalen Infoldings des RPE²⁰ bilden. Interessanterweise haben BLamDs sowohl bei Mäusen als auch bei Menschen eine ähnliche Proteinzusammensetzung und ein ähnliches Aussehen ^6,10,21. Neuere Arbeiten deuten darauf hin, dass BLamDs in der Pathobiologie der AMD eine Rolle spielen können, indem sie das Fortschreiten der AMD in ihre späteren Stadien beeinflussen^18,22; Daher können diese Ablagerungen erkranktes RPE in der Netzhaut der Maus darstellen. Das Wissen um diese Vorteile und Einschränkungen ist für Forscher, die daran interessiert sind, Ergebnisse aus Mausstudien auf AMD zu übertragen, von entscheidender Bedeutung.

In diesem Protokoll diskutieren wir die Methoden zur Vorbereitung der Augen auf Licht-, Transmissionselektronen- und konfokale Mikroskopie zur Visualisierung von RPE-Pathologien. Wir beschreiben auch, wie RPE-Pathologien für statistische Tests unvoreingenommen quantifiziert werden können. Als Proof-of-Concept verwenden wir das RPE-Phänotypisierungsprotokoll, um die strukturellen RPE-Pathologien zu untersuchen, die in transmembranprotein 135- (Tmem135) überexprimierenden Mäusen und gealterten Wildtyp (WT) C57BL/6J Mäusen beobachtet wurden. Zusammenfassend ist es unser Ziel, die Phänotypisierungsmethodik zur Charakterisierung des RPE in AMD-Mausmodellen zu beschreiben, da derzeit keine Standardprotokolle verfügbar sind. Forscher, die daran interessiert sind, Pathologien der Photorezeptoren oder der Aderhaut zu untersuchen und zu quantifizieren, die auch in AMD-Mausmodellen betroffen sind, finden dieses Protokoll möglicherweise nicht nützlich für ihre Studien.