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Immunology and Infection

Preparación de vectores lentivirales para la modulación eficiente de genes y microARN de macrófagos residentes en el tejido de la cavidad peritoneal in vivo en ratones

Published: February 16, 2024
doi:
10.3791/64926
, , , , , , ,
1Systems Immunity Research Institute, Division of Infection and Immunity,Cardiff University, 2Biomedical Sciences Unit, Faculty of Medicine, Health and Life Science,Swansea University, 3UK Dementia Research Institute

Summary

Demostramos un protocolo paso a paso para la investigación de la función génica en macrófagos residentes en tejido peritoneal in vivo, utilizando vectores lentivirales.

Abstract

Los macrófagos residentes en el tejido peritoneal tienen amplias funciones en el mantenimiento de la homeostasis y están implicados en patologías dentro de los tejidos locales y vecinos. Sus funciones están dictadas por señales microambientales; Por lo tanto, es esencial investigar su comportamiento en un nicho fisiológico in vivo . En la actualidad, las metodologías específicas de focalización de macrófagos peritoneales emplean modelos transgénicos de ratón entero. En este trabajo se describe un protocolo para la modulación eficaz in vivo de la expresión de ARNm y especies pequeñas de ARN (por ejemplo, microARN) en macrófagos peritoneales utilizando partículas de lentivirus. Las preparaciones de lentivirus se elaboraron en células HEK293T y se purificaron en una sola capa de sacarosa. La validación in vivo de la efectividad del lentivirus después de la inyección intraperitoneal reveló una infección predominante de macrófagos restringida al tejido local. La focalización de los macrófagos peritoneales fue exitosa durante la homeostasis y la peritonitis inducida por tioglicolato. Se discuten las limitaciones del protocolo, incluida la inflamación de bajo nivel inducida por la administración intraperitoneal de lentivirus y las restricciones de tiempo para posibles experimentos. En general, este estudio presenta un protocolo rápido y accesible para la evaluación rápida de la función génica en macrófagos peritoneales in vivo.

Introduction

Los macrófagos residentes en los tejidos (Mφ) son una población heterogénea de células inmunitarias fagocíticas que detectan y responden a patógenos invasores 1,2. Además, desempeñan un papel esencial en el desarrollo de los tejidos, la remodelación y el mantenimiento de la homeostasis 1,3. Muchos Mφ tisulares derivan de los progenitores del saco vitelino durante la embriogénesis y persisten en el tejido durante toda la vida 4,5. El fenotipo y las funciones de estas células están dictados por interacciones colaborativas y jerárquicas de factores de transcripción específicos y el microambiente local 6,7,8,9. Una creciente comprensión de esta dependencia aumenta la necesidad de métodos in vivo efectivos para la manipulación génica de Mφ dentro de su nicho fisiológicamente relevante.

Los vectores lentivirales son una herramienta frecuentemente empleada para la manipulación de ácidos nucleicos en poblaciones celulares específicas in vivo 10,11,12, particularmente debido a su capacidad para infectar tanto a las células en división como a las que no se dividen y para integrarse de manera estable en el genoma del huésped 13,14. En las últimas dos décadas, se ha optimizado la tecnología de administración de lentivirus y se han investigado sobres alternativos y promotores sintéticos para aumentar la focalización específica del linaje 8,15. Debido a su amplio tropismo celular, la glicoproteína envolvente del virus de la estomatitis vesicular (VSV-G)16,17 se ha convertido en la envoltura “estándar de oro” utilizada en la tecnología de lentivirus.

En este protocolo18, se emplean partículas lentivirales pseudotipadas de VSV-G para demostrar la entrega dirigida y efectiva de ARN de horquilla corta (shRNA) y microARN (miR) al Mφ peritoneal (pMφ) de ratón in vivo, en estado estacionario19. La expresión del transgén fue impulsada por el promotor del virus formador de foco del bazo (SFFV). La infección productiva de las células se definió por la expresión de la proteína verde fluorescente mejorada (GFP) derivada de lentivirus. La utilización de este enfoque permitió una lectura fácil de los experimentos in vivo con lentivirus para definir la dosis óptima y el marco temporal experimental. Por último, el desafío lentiviral in vivo de ratones durante la inflamación inducida por tioglicolato reveló la propensión natural a la infección selectiva por pMφ.

Protocol

Todo el trabajo con animales se llevó a cabo de acuerdo con las directrices institucionales y del Ministerio del Interior del Reino Unido. NOTA: Todos los estudios in vivo con lentivirus deben realizarse de acuerdo con las directrices locales y nacionales sobre el uso ético de animales en la investigación, así como cumplir con todas las regulaciones asociadas con el uso de materiales infecciosos de categoría II. El bienestar animal también debe …

Representative Results

Cuando se sigue completa y correctamente, este protocolo produce un total de 1,5 mL de stock de lentivirus de alta calidad por preparado individual, suficiente para doce inyecciones in vivo al volumen óptimo determinado en este estudio18. El éxito de la transfección se puede evaluar en una fase temprana del protocolo. Las células HEK293T sanas y confluentes deben mostrar, si están presentes en los plásmidos, una señal de marcador fácilmente detect…

Discussion

Los macrófagos residentes en los tejidos realizan una serie de funciones homeostáticas e inflamatorias específicas de los tejidos 1,2 dictadas por su entorno fisiológico 6,7,8,9. En este protocolo, se introdujo un método eficaz18 para la manipulación de macrófagos resident…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Esta investigación fue financiada, en su totalidad o en parte, por el Wellcome Trust Investigator Award [107964/Z/15/Z]. P.R.T también cuenta con el apoyo del Instituto de Investigación de la Demencia del Reino Unido. M.A.C cuenta con el apoyo de la beca Discovery del Consejo de Investigación en Biotecnología y Ciencias Biológicas (BB/T009543/1). A los efectos del acceso abierto, el autor ha aplicado una licencia pública de derechos de autor CC BY a cualquier versión del manuscrito aceptado por el autor que surja de este envío. L.C.D es profesor en la Universidad de Swansea e investigador honorario en la Universidad de Cardiff. Este trabajo se apoya en el trabajo realizado por Ipseiz et al. 202018.

Materials

0.05% Trypsin-EDTA (1x) (Trypsin 500 mg/L or 0.02 mM) Thermo Fisher Scientific 25300054
0.22 μm sterile millex GP filter Merck SLGS033SS
0.45 μm sterile millex GP filter Merck SLHP033RS
0.5 mL U-100 insulin syringe with needle, 0.33 mm x 12.7 mm (29 G) BD 324892
1 Litre Sharps Container N/A N/A
2.4G2 antibody (TruStain FcX anti-mouse CD16/32) Biolegend 101320
40 μm strainer Thermo Fisher Scientific 22363547
AimV medium (research grade), AlbuMax Supplement Thermo Fisher Scientific 31035025
Blocking buffer prepared in house
Brewer thioglycolate medium Sigma-Aldrich B2551 4% stock solution prepared in water, autoclaved and kept frozen.
CD11b Biolegend 101222 Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD11b BD 550993 Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD11c Biolegend 117317 Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD11c Biolegend 117333 Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD19 BD 560375 Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD19 Biolegend 152410 Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD226 Biolegend 128808 Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD3e BD 560527 Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD3e Biolegend 152313 Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD4 Biolegend 100412 Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD73 eBioscience 16-0731-82 Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD8a eBioscience 48-0081-82 Refer to Table 1 for the dilution and concentration
Cell culture flask (T175 fask, 175 cm2, 550 mL) Greiner Bio One 658175
Centrifuge tubes, conical bottom tubes 25 mm x 89 mm Beckman Coulter 358126
Centrifuges Beckman Coulter Ultracentrifuge and TC centrifuge
Collagenase type IV Sigma-Aldrich C5138
Conical centrifuge tubes (15 mL and 50 mL) Greiner Bio One 11512303 & 11849650
Cryotubes Greiner Bio One 123277 or cryotubes
DMEM medium (1x) + 4.5g/L D-glucose, 400 µM L-glutamine Thermo Fisher Scientific 41965-062
Dnase I Sigma-Aldrich 11284932001
Effectene transfection reagent Qiagen 301425
F4/80 Biolegend 123123 Refer to Table 1 for the dilution and concentration
F4/80 Biolegend 123133 Refer to Table 1 for the dilution and concentration
F4/80 Biolegend 123147 Refer to Table 1 for the dilution and concentration
FceR1 eBioscience 48-5898-80 Refer to Table 1 for the dilution and concentration
Fetal calf serum (FCS)  Thermo Fisher Scientific 10270-106 heat inactivated for 30 min at 56 °C and sterile filtered through 0.22 μm filter
Flow cytometer Thermo Fisher Scientific  Attune NxT
Flow cytometry (FACS) buffer prepared in house
Fluorescent tissue culture microscope Thermo Fisher Scientific EVOS FL
Forceps N/A N/A User preference
Hank's balanced salt solution (HBSS) Gibco, Life Technologies 14175-053
HEK293T cell line grown for at least a week prior transfection. Mycoplasma free
HIV-1 Core antigen Beckman Coulter 6604667
Hyaluronidase Sigma-Aldrich H3506
Hydrex surgical scrub, chlorhexiding gluconate 4% w/v skin cleanser Ecolab 3037170
I-A/I-E Biolegend 107625 Refer to Table 1 for the dilution and concentration
ICAM1 Becton Dickinson 554970 Refer to Table 1 for the dilution and concentration
Jurkat T cell line grown for at least a week prior use. Mycoplasma free
LIVE/DEAD fixable near-IR dead cell stain kit Thermo Fisher Scientific L34975
Ly6G Biolegend 127615 Refer to Table 1 for the dilution and concentration
Mice here used C57BL/6 females, aged 8-12 weeks (Charles Rivers), unless specified differently
Microcapillary pipettes (volume range 0.5-1,000 μL) Fisher Scientific & Starlab 11963466 & 11943466 & 11973466 & S1111-3700
NK1.1 Biolegend 108724 Refer to Table 1 for the dilution and concentration
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148-500G prepared to 2% w/v in PBS
pCMV-ΔR8.91 packaging plasmid Zuffrey, R., et al. 1997 encodes Gag-Pol HIV protein driven by cytomegalovirus promoter. Ampicilin resistance.
Penicillin/Streptomycin (100x, 10,000 U/mL) Thermo Fisher Scientific 15140122
Petri dish Greiner Bio One 664160
pHR'SIN-cPPT-SEW plasmid Rosas, M. et al. 2014 modified for shRNA and miR expression studies. Encodes EGFP marker downstream SFFV promoter and upstream of the Woodchuck hepatitiv virus enhancer. Ampicilin resistance.
pMD2.G plasmid Naldini, L. et al. 1996 encodes vesicular stomatis virus g-glycoprotein (VSV-G) envelope. Ampicilin resistance.
Rat IgG1, κ isotype control Becton Dickinson 550617 Refer to Table 1 for the dilution and concentration
Rat serum Sigma-Aldrich R9759-10ML
Red blood ACK lysis buffer prepared in house
RPMI 1640 medium (1x) + 400 uM L-glutamine Thermo Fisher Scientific 21875-091
Saponin Sigma-Aldrich S4521
SiglecF BD 562681 Refer to Table 1 for the dilution and concentration
Sodium hypochlorite Tablets (bleach, 2,000 ppm) Guest Medical H8818
Sterile 24-well cell culture plate Greiner Bio One 662160
Sterile Dulbecco's PBS (DPBS) (1x) Mg++ and Ca2+ – free Thermo Fisher Scientific 14190144
Sterile EDTA Thermo Fisher Scientific 15575020
Sterile VWR disposable transfer pipets (23.0 mL, 30 cm) VWR 612-4515
Sucrose Thermo Fisher Scientific 15503022
surgical scissors N/A N/A User preference
Syringes (50 mL and 1 0mL) Fisher Scientific 10084450 & 768160
Tim4 Biolegend 130007 Refer to Table 1 for the dilution and concentration
U-bottom 96-well cell culture plate Greiner Bio One 650180
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References

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