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Abstract
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Immunology and Infection

Préparation de vecteur lentiviral pour une modulation efficace des gènes et des microARN de macrophages résidents dans les tissus de la cavité péritonéale in vivo chez la souris

Published: February 16, 2024
doi:
10.3791/64926
, , , , , , ,
1Systems Immunity Research Institute, Division of Infection and Immunity,Cardiff University, 2Biomedical Sciences Unit, Faculty of Medicine, Health and Life Science,Swansea University, 3UK Dementia Research Institute

Summary

Nous démontrons un protocole étape par étape pour l’étude de la fonction des gènes dans les macrophages résidents du tissu péritonéal in vivo, en utilisant des vecteurs lentiviraux.

Abstract

Les macrophages résidents du tissu péritonéal ont de larges fonctions dans le maintien de l’homéostasie et sont impliqués dans des pathologies au sein des tissus locaux et voisins. Leurs fonctions sont dictées par des signaux microenvironnementaux ; Ainsi, il est essentiel d’étudier leur comportement dans une niche physiologique in vivo . À l’heure actuelle, des méthodologies spécifiques de ciblage des macrophages péritonéaux utilisent des modèles transgéniques de souris entières. Ici, un protocole pour une modulation in vivo efficace de l’expression de l’ARNm et des petites espèces d’ARN (par exemple, les microARN) dans les macrophages péritonéaux à l’aide de particules de lentivirus est décrit. Des préparations de lentivirus ont été fabriquées dans des cellules HEK293T et purifiées sur une seule couche de saccharose. La validation in vivo de l’efficacité du lentivirus après injection intrapéritonéale a révélé une infection prédominante des macrophages limitée aux tissus locaux. Le ciblage des macrophages péritonéaux a été couronné de succès pendant l’homéostasie et la péritonite induite par les thioglycolates. Les limites du protocole, y compris l’inflammation de faible niveau induite par l’administration intrapéritonéale de lentivirus et les restrictions de temps pour les expériences potentielles, sont discutées. Dans l’ensemble, cette étude présente un protocole rapide et accessible pour l’évaluation rapide de la fonction des gènes dans les macrophages péritonéaux in vivo.

Introduction

Les macrophages tissulaires (Mφ) sont une population hétérogène de cellules immunitaires phagocytaires qui détectent et répondent aux agents pathogènes envahissants 1,2. De plus, ils jouent un rôle essentiel dans le développement des tissus, le remodelage et le maintien de l’homéostasie 1,3. De nombreux tissus Mφ dérivent des progéniteurs du sac vitellin au cours de l’embryogenèse et persistent dans le tissu tout au long de la vie 4,5. Le phénotype et les fonctions de ces cellules sont dictés par les interactions collaboratives et hiérarchiques de facteurs de transcription spécifiques et du microenvironnement local 6,7,8,9. Une compréhension croissante de cette dépendance augmente le besoin de méthodes in vivo efficaces pour la manipulation génétique de Mφ dans leur niche physiologiquement pertinente.

Les vecteurs lentiviraux sont un outil fréquemment utilisé pour la manipulation des acides nucléiques dans des populations cellulaires spécifiques in vivo 10,11,12, en particulier en raison de leur capacité à infecter à la fois les cellules en division et les cellules non divisées et à s’intégrer de manière stable dans le génome de l’hôte 13,14. Au cours des deux dernières décennies, la technologie d’administration des lentivirus a été optimisée, et des enveloppes alternatives et des promoteurs synthétiques ont été étudiés pour augmenter le ciblage spécifique à la lignée 8,15. En raison de son large tropisme cellulaire, la glycoprotéine d’enveloppe du virus de la stomatite vésiculeuse (VSV-G)16,17 est devenue l’enveloppe de référence utilisée dans la technologie des lentivirus.

Dans ce protocole18, des particules lentivirales pseudotypées VSV-G sont utilisées pour démontrer l’administration ciblée et efficace de l’ARN en épingle à cheveux court (shRNA) et du microARN (miR) à Mφ (pMφ) péritonéal de souris in vivo, à l’état d’équilibre19. L’expression du transgène a été déterminée par le promoteur du virus formant un foyer de la rate (SFFV). L’infection productive des cellules a été définie par l’expression de la protéine fluorescente verte (GFP) améliorée dérivée du lentivirus. L’utilisation de cette approche a permis une lecture facile pour les expériences de lentivirus in vivo afin de définir la dose optimale et la période expérimentale. Enfin, la provocation lentivirale in vivo de souris au cours de l’inflammation induite par le thioglycolate a révélé la propension naturelle à l’infection sélective par pMφ.

Protocol

Tous les travaux sur les animaux ont été effectués conformément aux directives de l’Institutional et du Home Office du Royaume-Uni. REMARQUE : Toutes les études in vivo avec des lentivirus doivent être réalisées conformément aux directives locales et nationales sur l’utilisation éthique des animaux en recherche, ainsi qu’à toutes les réglementations associées à l’utilisation de matières infectieuses de catégorie II. Le bien-êt…

Representative Results

Lorsqu’il est suivi intégralement et correctement, ce protocole produit un total de 1,5 mL de stock de lentivirus de haute qualité par préparation unique, ce qui est suffisant pour douze injections in vivo au volume optimal déterminé dans cette étude18. Le succès de la transfection peut être évalué tôt dans le protocole. Les cellules HEK293T saines et confluentes devraient présenter, si elles sont présentes dans les plasmides, un signal mar…

Discussion

Les macrophages résidents dans les tissus remplissent une gamme de fonctions homéostatiques et inflammatoires spécifiques aux tissus 1,2 dictées par leur environnement physiologique 6,7,8,9. Dans ce protocole, une méthode efficace18 de manipulation des macrophages résidents…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Cette recherche a été financée, en tout ou en partie, par le Wellcome Trust Investigator Award [107964/Z/15/Z]. P.R.T est également soutenu par le UK Dementia Research Institute. M.A.C est soutenu par la bourse de découverte du Conseil de recherches en biotechnologie et en sciences biologiques (BB/T009543/1). Aux fins de l’Open Access, l’auteur a appliqué une licence de droit d’auteur publique CC BY à toute version du manuscrit accepté par l’auteur découlant de cette soumission. L.C.D est maître de conférences à l’Université de Swansea et chercheur honoraire à l’Université de Cardiff. Ces travaux sont étayés par les travaux menés par Ipseiz et al. 202018.

Materials

0.05% Trypsin-EDTA (1x) (Trypsin 500 mg/L or 0.02 mM) Thermo Fisher Scientific 25300054
0.22 μm sterile millex GP filter Merck SLGS033SS
0.45 μm sterile millex GP filter Merck SLHP033RS
0.5 mL U-100 insulin syringe with needle, 0.33 mm x 12.7 mm (29 G) BD 324892
1 Litre Sharps Container N/A N/A
2.4G2 antibody (TruStain FcX anti-mouse CD16/32) Biolegend 101320
40 μm strainer Thermo Fisher Scientific 22363547
AimV medium (research grade), AlbuMax Supplement Thermo Fisher Scientific 31035025
Blocking buffer prepared in house
Brewer thioglycolate medium Sigma-Aldrich B2551 4% stock solution prepared in water, autoclaved and kept frozen.
CD11b Biolegend 101222 Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD11b BD 550993 Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD11c Biolegend 117317 Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD11c Biolegend 117333 Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD19 BD 560375 Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD19 Biolegend 152410 Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD226 Biolegend 128808 Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD3e BD 560527 Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD3e Biolegend 152313 Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD4 Biolegend 100412 Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD73 eBioscience 16-0731-82 Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD8a eBioscience 48-0081-82 Refer to Table 1 for the dilution and concentration
Cell culture flask (T175 fask, 175 cm2, 550 mL) Greiner Bio One 658175
Centrifuge tubes, conical bottom tubes 25 mm x 89 mm Beckman Coulter 358126
Centrifuges Beckman Coulter Ultracentrifuge and TC centrifuge
Collagenase type IV Sigma-Aldrich C5138
Conical centrifuge tubes (15 mL and 50 mL) Greiner Bio One 11512303 & 11849650
Cryotubes Greiner Bio One 123277 or cryotubes
DMEM medium (1x) + 4.5g/L D-glucose, 400 µM L-glutamine Thermo Fisher Scientific 41965-062
Dnase I Sigma-Aldrich 11284932001
Effectene transfection reagent Qiagen 301425
F4/80 Biolegend 123123 Refer to Table 1 for the dilution and concentration
F4/80 Biolegend 123133 Refer to Table 1 for the dilution and concentration
F4/80 Biolegend 123147 Refer to Table 1 for the dilution and concentration
FceR1 eBioscience 48-5898-80 Refer to Table 1 for the dilution and concentration
Fetal calf serum (FCS)  Thermo Fisher Scientific 10270-106 heat inactivated for 30 min at 56 °C and sterile filtered through 0.22 μm filter
Flow cytometer Thermo Fisher Scientific  Attune NxT
Flow cytometry (FACS) buffer prepared in house
Fluorescent tissue culture microscope Thermo Fisher Scientific EVOS FL
Forceps N/A N/A User preference
Hank's balanced salt solution (HBSS) Gibco, Life Technologies 14175-053
HEK293T cell line grown for at least a week prior transfection. Mycoplasma free
HIV-1 Core antigen Beckman Coulter 6604667
Hyaluronidase Sigma-Aldrich H3506
Hydrex surgical scrub, chlorhexiding gluconate 4% w/v skin cleanser Ecolab 3037170
I-A/I-E Biolegend 107625 Refer to Table 1 for the dilution and concentration
ICAM1 Becton Dickinson 554970 Refer to Table 1 for the dilution and concentration
Jurkat T cell line grown for at least a week prior use. Mycoplasma free
LIVE/DEAD fixable near-IR dead cell stain kit Thermo Fisher Scientific L34975
Ly6G Biolegend 127615 Refer to Table 1 for the dilution and concentration
Mice here used C57BL/6 females, aged 8-12 weeks (Charles Rivers), unless specified differently
Microcapillary pipettes (volume range 0.5-1,000 μL) Fisher Scientific & Starlab 11963466 & 11943466 & 11973466 & S1111-3700
NK1.1 Biolegend 108724 Refer to Table 1 for the dilution and concentration
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148-500G prepared to 2% w/v in PBS
pCMV-ΔR8.91 packaging plasmid Zuffrey, R., et al. 1997 encodes Gag-Pol HIV protein driven by cytomegalovirus promoter. Ampicilin resistance.
Penicillin/Streptomycin (100x, 10,000 U/mL) Thermo Fisher Scientific 15140122
Petri dish Greiner Bio One 664160
pHR'SIN-cPPT-SEW plasmid Rosas, M. et al. 2014 modified for shRNA and miR expression studies. Encodes EGFP marker downstream SFFV promoter and upstream of the Woodchuck hepatitiv virus enhancer. Ampicilin resistance.
pMD2.G plasmid Naldini, L. et al. 1996 encodes vesicular stomatis virus g-glycoprotein (VSV-G) envelope. Ampicilin resistance.
Rat IgG1, κ isotype control Becton Dickinson 550617 Refer to Table 1 for the dilution and concentration
Rat serum Sigma-Aldrich R9759-10ML
Red blood ACK lysis buffer prepared in house
RPMI 1640 medium (1x) + 400 uM L-glutamine Thermo Fisher Scientific 21875-091
Saponin Sigma-Aldrich S4521
SiglecF BD 562681 Refer to Table 1 for the dilution and concentration
Sodium hypochlorite Tablets (bleach, 2,000 ppm) Guest Medical H8818
Sterile 24-well cell culture plate Greiner Bio One 662160
Sterile Dulbecco's PBS (DPBS) (1x) Mg++ and Ca2+ – free Thermo Fisher Scientific 14190144
Sterile EDTA Thermo Fisher Scientific 15575020
Sterile VWR disposable transfer pipets (23.0 mL, 30 cm) VWR 612-4515
Sucrose Thermo Fisher Scientific 15503022
surgical scissors N/A N/A User preference
Syringes (50 mL and 1 0mL) Fisher Scientific 10084450 & 768160
Tim4 Biolegend 130007 Refer to Table 1 for the dilution and concentration
U-bottom 96-well cell culture plate Greiner Bio One 650180
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References

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